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一株H5N1亚型猪流感病毒的进化分析及其反向遗传操作系统的建立

作　者: 李婷
导　师: 冉多良；李海燕
学　校: 新疆农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: H5N1亚型猪流感病毒分子遗传演化反向遗传操作
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

为了解首次从中国福建省分离到的一株H5N1亚型猪流感病毒A/Swine/Fujian/F1/01(H5N1)分子遗传演化和生物学特性,本研究对这株病毒进行了全基因组序列测定,对其各个基因片段进行比较并绘制进化树,最后建立了该病毒反向遗传操作系统。全基因组序列测定和遗传演化分析结果表明,我国分离的这株H5N1亚型猪流感病毒的8个基因片段均来自禽源流感病毒,该病毒的核苷酸和推导的氨基酸序列与H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/Duck/Zhejiang/52/00(H5N1)的同源性最高,均在99.3%以上,说明二者亲缘关系最近;与97年香港感染人的流感病毒HK/483/97、HK/486/97同源性不高,与人流感病毒HK/213/03的同源性较高,关系较近;部分内部基因与04年东南亚人、猫、老虎分离株的同源性在98.8%以上。本病毒对SPF鸡呈高致病性,静脉接种致病指数为2.52,平均死亡时间为2.4d;鼻腔感染鸡后病毒迅速突破呼吸系统进入到包括脑在内的几乎所有的实质性脏器,有典型的临床症状。病毒分离结果显示肺、肝、胰腺病毒含量最高,心、脾、脑、肾、法氏囊中也可分离到高滴度的病毒,表明病毒可在鸡多个组织器官内复制并产生明显病理变化,并具有广泛的组织嗜性。研究表明该病毒在由禽类传播给猪的过程中对禽的高致病性未发生改变。本研究揭示了H5N1亚型猪流感病毒A/Swine/Fujian/F1/01(H5N1)的遗传演化关系,为我国H5N1亚型猪流感病毒的遗传演化研究提供了数据;同时应用反向遗传操作技术成功拯救出了病毒,为今后进一步研究我国H5N1亚型猪流感病毒的致病机制、病毒的结构与功能、筛选新型疫苗毒株奠定实验和理论基础。

全文目录

第一章引言  8-17
  1.1 流感的发展历史  8
  1.2 流感病毒研究进展  8-11
    1.2.1 流感病毒病原结构  8
    1.2.2 流感病毒的分子生物学特性  8-11
    1.2.3 流感病毒的复制  11
  1.3 猪流感简介  11-13
    1.3.1 猪流感的历史事件  12
    1.3.2 猪流感的公共卫生意义  12-13
  1.4 产生导致人流感大流行病毒株的可能机制  13
    1.4.1 猪作为中间宿主  13
    1.4.2 AIV直接传播给人  13
  1.5 A型流感病毒的反向遗传操作系统  13-16
    1.5.1 流感病毒反向遗传技术的发展过程  14-15
    1.5.2 流感病毒反向遗传技术的应用  15-16
  1.6 研究目的与意义  16-17
第二章猪流感病毒Swine/Fujian/F1/01(H5N1)序列测定及遗传演化分析  17-33
  2.1 材料  17
    2.1.1 病毒  17
    2.1.2 SPF鸡胚  17
    2.1.3 主要试剂  17
    2.1.4 引物  17
  2.2 方法  17-20
    2.2.1 病毒增殖和血清学鉴定  17
    2.2.2 病毒RNA的提取  17-18
    2.2.3 RT-PCR  18
    2.2.4 PCR产物回收和纯化  18-19
    2.2.5 PCR产物直接测序  19
    2.2.6 病毒核酸序列与氨基酸序列分析  19-20
  2.3 结果  20-30
    2.3.1 病毒RNA的RT-PCR产物电泳鉴定结果  20-21
    2.3.2 流感病毒全基因组序列测定结果与各基因的分子遗传衍化分析  21-30
  2.4 讨论  30-33
    2.4.1 HA基因  30-31
    2.4.2 NA基因  31
    2.4.3 内部基因  31-33
第三章猪流感病毒SWINE/FUJIAN/F1/01(H5N1)对鸡的致病性实验  33-37
  3.1 材料  33
    3.1.1 病毒分离株  33
    3.1.2 实验动物  33
  3.2 方法  33-34
    3.2.1 病毒的鸡胚半数感染量（EID_(50)）的测定  33
    3.2.2 病毒对鸡的静脉接种致病指数(IVPI)的测定  33
    3.2.3 病毒对鸡的鼻腔感染试验及病毒对鸡的组织嗜性试验  33-34
  3.3 结果  34-35
    3.3.1 病毒EID_(50)测定结果  34
    3.3.2 病毒静脉接种致病指数(IVPI)的测定  34-35
    3.3.3 病毒对鸡的鼻腔感染试验和对鸡的组织嗜性试验结果  35
  3.4 讨论  35-37
第四章猪流感病毒Swine/Fujian/F1/01(H5N1)反向遗传操作系统的建立  37-44
  4.1 材料  37-38
    4.1.1 病毒  37
    4.1.2 鸡胚  37
    4.1.3 pBD载体  37
    4.1.4 主要试剂  37
    4.1.5 引物  37-38
  4.2 方法  38-41
    4.2.1 病毒RNA提取、反转录与PCR  38
    4.2.2 重组pBD质粒的构建  38-40
    4.2.3 病毒的拯救  40-41
  4.3 结果  41-43
    4.3.1 病毒RNA的RT–PCR琼脂糖凝胶电泳鉴定结果  41-42
    4.3.2 Klenow大片段酶处理pBD载体DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定结果  42
    4.3.3 粗提pBD克隆质粒PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳结果  42
    4.3.4 阳性pBD克隆质粒琼脂糖凝胶电泳鉴定结果  42-43
    4.3.5 阳性pBD克隆质粒序列测定结果  43
    4.3.6 救获病毒鉴定结果  43
  4.4 讨论  43-44
结论  44-45
参考文献  45-50
附录  50-55
致谢  55-56
作者简介  56

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