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β-D-半乳糖苷酶活性测定方法的建立及其在消化道肿瘤中的活性变化

作　者: 周晓辉
导　师: 温进坤
学　校: 河北医科大学
专　业: 中西医结合基础
关键词: β-D-半乳糖苷酶基质金属蛋白酶-9 粘膜消化道肿瘤
分类号: R735
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

目的：建立一种简便的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Galactosidase,GAL,EC 3.2.1.23)活性测定方法，并利用此方法，检测消化道不同区段粘膜中GAL活性，旨在确定该酶在消化道中的分布及在肿瘤组织中含量的变化及其与肿瘤转移的关系。方法：1．GAL活性测定方法的建立：(1)酶提取液的制备：刮取粘膜组织按5ml／g加入提取液(10mmol／L磷酸缓冲液，pH6.5)制备匀浆。4℃，12000r／min离心20min。取上清液进行蛋白定量，以牛血清白蛋白为标准物。(2)GAL活性的测定：酶提取液蛋白含量测定用改良酚试剂法，以牛血清白蛋白为标准物。在总体积为1ml的0.1mol／L柠檬酸反应缓冲液(pH4.5)体系中含0.8μmol的邻硝基苯β-D-吡喃半乳糖(ONPG)，酶提取液适量，相当于2mg左右蛋白质。37℃孵育30min后，用0.5mol／L冷碳酸钠1ml终止反应，用紫外分光光度计于405nm波长测定吸光度值。同时设定底物对照和酶提取液对照。酶活力单位U定义为标准条件下(pH4.5，37℃)每分钟催化生成1μmol产物邻硝基苯酚(ONP)所需的酶量为1个单位。在相同条件下，对该方法的精密度、重复性、灵敏度、线性关系及回收率进行评价。 2．人消化道各区段粘膜中GAL活性的测定：行根中文摘要治性手术的消化道肿瘤患者引例，其中直肠癌8例、结肠癌6例、贲门癌6例、胃癌5例、食管癌6例。病理学检查证实，食管癌为鳞状上皮癌，其余为腺癌。实验材料为外科手术切除的带有正常组织（作为对照）的消化道肿瘤标本。正常组织远离肿瘤组织至少 10cm。分别制备不同标本粘膜中的GAL提取液，用所建立的方法检测其活性。 3．消化道不同组织MMPg活性的测定：用明胶－酶图法检狈直肠（6例）、结肠（5例）、贲＊（6例）、胃（5例）。食管K例）正常及肿瘤粘膜中MMPg的相对活性。即配制分离胶8％，含明胶Zmg／ml（w／V，浓缩胶5％。提驭后的样品不经加热，与等体积的 2 X SDS非还原上样缓冲液在京温下混匀后直接上样，每孔上样蛋白量为 200 u g。4℃ 条件下恒压门）电泳至涅酚蓝达凝胶底部（约Zh人电泳结束后，剥离凝胶置 2．5％Triton X刁中在摇床上低速摇动以洗脱 SDS井复性，15min X 2次。然后，将凝胶移入凝胶酶缓冲液，37OC孵育。次日取出凝胶，染色后，脱色到出现清晰的白色负染酶带。观察MMP习对凝胶中所含明胶的降解活性，显影条带输入计算机，用 Kodak公司 ID数码成像分析系统软件进行定量分析，以明胶降解所形成的白色带亮度表示MMP习活性。结果：1．GAL活性测定方法的建立：用本实验所建立的分光光度法检测GAL活性，结果显示，该方法的批内变异系数在3．92％～4．89％之间；批间变异系数为3．8％，均小于5％，说明该方法的精密度和重复性均符合标准；该方法测得的酶活性最小可检出限为0．sing，酶中文摘要提取液的蛋白含量在1刀～3刀mg 时线性关系最佳（，0．99人说明该方法灵敏度较高、稳定性好；平均回收率共测5组，每组均大于95％，说明在所检测浓度范围内回收良好。因此，该方法具有精密度高、重复性好、简便易行等优点。 2．人消化道不同部位粘膜中GAL活性：在所检测的人消化道不同区段正常粘膜中均有GAL的存在，其中以直肠、结肠粘膜中GAL活性最高，分别为0．43）0刀3 和0．47L0刀5；在癌变的直肠和结肠粘膜组织中的GAL 活性分别为 0．77t0＊7不 0．60＊0＊6，显著高于各自正常对照组织（P＜0．05）。而癌变的胃（0．34f0．05）、贲门（0．4710二0）、食管（0．35f0＊6）组织比正常的胃（0．26L0＊2）、贡门（0．25L0＊2）、食管（0．17fo＊3）粘膜中的＊AL活性虽有所升高，但无统计学意义（P＞0刀5人 3．消化道不同部位MIMq活性：结果显示，在人消化道癌变组织提取液中均有明胶酶的存在，且以92kD 的明胶酶B（MMP习）为主。消化道各肿瘤组织中的 ip习相对活性依次为结肠（88刀0a．72）＞食管（64．1716．90）＞贲门（64．0012．73）＞胃（50．8015．20）＞直肠N6．00f3．比，而各良正常粘膜中MND习相对活性依次为贲门（52．0012．49）＞结肠（50．8018．98）＞直肠（38．33土2＊4）＞胃（31＊0土3＊5）＞食管（26＊7土7．19）。经统计学分析，各肿瘤组织中的MIM习相对活性显著高于各自正常粘膜组织（P＜o．05人其中以食管肿瘤粘膜中 MMP习活性升高幅度最大。结论：上述结果表明，正常消化道粘膜中均可检测 3 中文摘要到较高的GAL及Mg活性，这可能与糖的消化吸收和腺细胞更新活跃有关。在相应的肿瘤粘膜中，两种酶的活性均明显升高

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
研究论文 β-D-半乳糖苷酶活性测定方法的建立及其在消化道肿瘤中的活性变化  13-33
  前言  13-14
  材料和方法  14-18
  结果  18-20
  讨论  20-22
  小结  22-23
  参考文献  23-25
  附表、附图  25-33
综述  33-46
致谢  46-47
个人简历  47

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