人前列腺癌诱导基因1(Prostate carcinoma tumor-inducing gene 1,PTI-1)是1995年，美国哥伦比亚大学的Fisher PB等在对前列腺癌的发病机理的研究时从人前列腺癌细胞系LNCaP中克隆获得的发挥显性作用的肿瘤诱导基因。PTI-1的cDNA 5’端非翻译区" />

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前列腺癌诱导基因PTI-1的克隆、表达和多克隆抗体的制备及应用

作　者: 付振虹
导　师: 王禾；杨安钢
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 人前列腺癌诱导基因 RT-PCR 序列测定前列腺癌基因载体构建原核表达 PTI-1 多克隆抗体免疫组化
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

前列腺癌诱导基因的学位论文">人前列腺癌诱导基因1(Prostate carcinoma tumor-inducing gene 1,PTI-1)是1995年，美国哥伦比亚大学的Fisher PB等在对前列腺癌的发病机理的研究时从人前列腺癌细胞系LNCaP中克隆获得的发挥显性作用的肿瘤诱导基因。PTI-1的cDNA 5’端非翻译区为620个碱基(1-620bp)，3’端非翻译区为189个碱基(1818-2106bp)，具有位于621-1814bp的一个开放阅读框，此区编码一个由398个氨基酸组成的蛋白质，它的编码产物是截短和突变型EF-1α分子，以赖氨酸结尾。与正常的人EF-1α核苷酸序列相比，PTI-1蛋白有完全相同的C末端，但N末端缺失67个氨基酸。研究表明，PTI-1基因具有癌基因特性，在调控前列腺癌演变过程中发挥重要作用，前列腺癌患者外周血中检测到PTI-1的cDNA。为获取人前列腺癌诱导基因家族新成员，以人前列腺癌细胞系PC-3的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增人前列腺癌诱导基因1(PTI-1)，将其亚克隆至克隆载体pUC19，进行测序。将克隆得到的PTI-1基因片段与国外报道的人PTI-1基因编码区cDNA同源性为99.3％，但第726、746、1167、1270、付枉虹剪四罩医大学硕士学位论文第5 页 1326、1449、1694和 1695位碱基分别山 A、A、C、C、A、A、T和 C tA代了文献中的C、C、G、G、G、C、C和T。其中6个碱基的不同，导致了第“36、183、217、236、277和359位密码于代表的氨基酸分别山Lys M代Gin， Afg替代 Gly，Ala替代 Gly，Ser替代 Gly，Thr 8代 Pro和 Arg M代＊·s。我们将所获得的基因在GenBank登录，登录号为AF397403。结果提示获得了 PTI－l家族新成员，并且与 EFIQ分子的同源性较己报道的PTIl高。将我们从PC－3细胞中克隆获得的PTI－l基因插入表达载体PGEX4T．l中，构建重组表达载体 PTI刁／pGEX4T刁，酶谱分析鉴定出干确的重组质粒，在大肠杆菌中诱导融合表达，进行SDS－PAGE分析，应用GSH树脂纯化表达产物。筛选出5个与pGEX4TJ正向重组质粒，其中一株表达一个入介为 69．okD的新蛋白，并以包涵体的形式存在，蛋白在宿主菌中高效表达，表达量为43．2％，纯化蛋白得到纯度为79．72％的GST／PTI．l融合蛋白。以大肠杆菌表达的谷脱甘肽 S转移酶（GST＊ PTI刁蛋白为抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体，用ELISA方法检测制备的抗血清效价，应用制备的抗体对前列腺癌中PTI的分布进行检测。ELISA检测显示所制备的抗体与纯化的GSTrpTll蛋白反应效价为1：3200。对4例具有较为典型体征、临床诊断为6U列腺癌病人的病理标本进行免疫组化检测，发现有PTI表达，主要分布在细胞质内，并且观察到在癌组织和良性增生组织中PTIl差异表达。PTI多克隆抗体的制备为进一步研究奠定基础。

全文目录

英文缩略词语  4-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-12
文献回顾  12-24
研究内容  24-62
  第一部分人前列腺癌细胞系PC-3中PTI-1cDNA的克隆及序列分析  24-39
  第二部分 PTI-1表达载体构建及在大肠杆菌中的高效表达和纯化  39-51
  第三部分前列腺癌诱导基因多克隆抗体的制备及应用  51-62
小结  62-63
致谢  63-64
硕士在读期间发表的论文  64-65
附录  65-67

前列腺癌诱导基因PTI-1的克隆、表达和多克隆抗体的制备及应用

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