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人Neuritin蛋白在杆状病毒表达系统的表达和初步功能鉴定

作　者: 黄延红
导　师: 黄瑾；高剑峰；杨磊；周宗瑶
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Neuritin bac-to-bac杆状病毒表达系统鸡胚背根神经节
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 61次
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内容摘要

神经营养因子是一类促进神经细胞存活、生长、分化的多肽分子,在神经系统发育、分化和损伤修复过程中发挥重要的作用[1]。neuritin是一种新发现的神经营养因子,1993年由以色列科学家Nedivi等人从大鼠海马齿状脑回cDNA文库中筛选得到[1]。Neuritin蛋白随后的功能研究显示Neuritin蛋白能促进神经突起的生长及其分支和突触的发育成熟,调节突触回路的形成;其表达主要局限于神经系统以及神经可塑性相关的区域,且神经活动和NTs均能诱导其表达,提示neuritin可能与神经活动和NTs促进神经突起生长的作用有关[3]。因此,深入研究探讨Neuritin的功能及作用机制,有助于神经再生和神经退行性疾病的防治。目前对neuritin的功能研究主要集中在神经再生方面,这些研究主要是用原核表达产物来进行的,尚未见到对其真核表达产物进行功能研究的报道。目的:利用bac-to-bac杆状病毒表达系统进行Neuritin蛋白的表达,得到neuritin基因的真核表达产物,neuritin的功能研究奠定基础。方法:在全长neuritin cDNA的基础上设计引物,扩增得到neuritin ORF,将其克隆到供体质粒pFastBacHT中,经PCR、酶切和测序鉴定后,将测序正确的质粒转化DH10Bac菌,经筛选、鉴定后,抽提并获取高纯度的重组穿梭载体Bacmid-neuritin。用脂质体介导法将重组穿梭载体Bacmid-neuritin转染Sf9细胞,获得重组病毒,并反复扩增后得到大量表达Neuritin蛋白的重组病毒。用重组的杆状病毒再次感染sf9细胞得到Neuritin融合蛋白,融合蛋白经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。进一步优化Neuritin融合蛋白的表达时间,再将表达产物加入到鸡胚背根神经节的培养基中,对其功能进行初步鉴定。结果:1.构建了携带neuritin基因片段的重组供体质粒pfastbacHT-neuritin,经双酶切鉴定和序列分析证实neuritin基因已正确插入供体质粒的多克隆位点。2.构建了携带neuritin基因片段的重组穿梭载体Bacmid-neuritin,经PCR鉴定分析证实neuritin基因已正确转座插入穿梭载体的转座位点。3.用bac-to-bac系统表达了Neuritin融合蛋白,并经SDS-PAGE、Western- blot分析鉴定,

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中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
主要符号表  10-11
前言  11-14
材料和方法  14-30
  1. 材料  14-17
  2. 方法  17-30
    2.1 转移载体的构建  17-22
    2.2 重组杆粒的构建  22-24
    2.3 重组病毒的包装和扩增  24-26
    2.4 目的蛋白的表达和表达产物的鉴定  26-28
    2.5 蛋白表达条件的优化  28-29
    2.6 表达产物的初步功能鉴定  29-30
结果  30-40
  1. 重组转移质粒pfastbac-HT-neuritin 的鉴定  30-31
  2. 重组杆粒的鉴定  31-33
  3. 病毒感染的sf9 细胞的结果  33
  4. 融合 Neuritin 蛋白表达的鉴定结果  33-36
  5. 蛋白收获条件的优化结果  36-38
  6. Neuritin 蛋白的功能鉴定结果  38-40
讨论  40-44
结论  44-45
参考文献  45-48
文献综述  48-62
致谢  62-63
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表  63

人Neuritin蛋白在杆状病毒表达系统的表达和初步功能鉴定

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