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LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建和初步应用

作　者: 朱伟
导　师: 罗兵
学　校: 青岛大学
专　业: 病原生物学
关键词: LMP2A BZLF1 融合基因 腺病毒 真核表达
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


目的 将EBV潜伏膜蛋白编码基因LMP2A和EBV即刻早期基因BZLF1进行融合,构建融合基因的重组腺病毒表达载体,旨在同时发挥LMP2A诱导特异性CTL和BZLF1基因产物诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用,从而协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞,为EBV相关肿瘤特异性治疗的临床应用研究奠定试验基础。 方法 自EBV阳性细胞提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸（spliced overlap exetension,SOE）技术,将两段基因通过多肽接头（Gly4Ser）3 DNA序列连接以获得融合基因（Z2A）。进一步将Z2A融合基因定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组,构建Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,包装获得重组腺病毒vAd-Z2A。流式细胞术检测重组腺病毒感染EBV阳性鼻咽癌细胞CNE诱导的凋亡。 结果 ①重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到31kb和4.5kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;②RT-PCR显示重组腺病毒感染的CNE细胞可检测到融合基因表达;③Western Blotting可检测到融合蛋白的表达;④流式细胞术检测显示重组腺病毒感染CNE细胞诱导的凋亡与vAd-LacZ载体对照和空白对照比较差异均有统计学意义（P<0.001）。 结论 本研究成功构建了EBV潜伏膜蛋白基因LMP2A和即刻早期基因BZLF1融合基因的重组腺病毒表达载体,并在293细胞中包装获得重组腺病毒vAd-Z2A,重组腺病毒vAd-Z2A可在靶细胞内稳定表达目的基因并能诱导EBV阳性CNE细胞的凋亡。

全文目录


引言  6
第一章 材料与方法  6-20
  1.仪器、试剂和耗材  6-9
  2.目的基因的制备  9-12
  3.构建LMP2A和BZLF1融合基因Z2A  12-14
  4.腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-Z2A的构建  14-16
  5.在RecA~+ BJ5183宿主菌中构建重组子  16-18
  6.重组腺病毒载体转染293细胞  18-19
  7.重组腺病毒融合基因的表达  19-20
  8.重组腺病毒对EBV阳性鼻咽癌细胞CNE的作用  20
第二章 结果  20-28
  1.目的基因RT-PCR电泳结果  20-21
  2.融合基因PCR电泳结果  21-22
  3.融合基因的序列测定  22-23
  4.腺病毒质粒穿梭载体pAdTrack-CMV-Z2A的鉴定  23-24
  5.大肠杆菌RecA~+ BJ5183中重组腺病毒载体pAd-Z2A的构建  24-25
  6.重组腺病毒载体的包装  25-26
  7.EBV阳性CNE细胞中重组腺病毒的表达  26-27
  8.流式细胞术检测靶细胞的凋亡  27-28
第三章 讨论  28-33
  1.载体选择  28-30
  2.目的基因的选择和融合  30-32
  3.EBV融合基因Z2A腺病毒表达载体的构建  32
  4.展望  32-33
第四章 结论  33-34
附图1  34-35
参考文献  35-39
综述  39-60
攻读学位期间的研究成果  60-61
致谢  61-62
学位论文独创性和知识产权权属声明  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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