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牛瑟氏泰勒虫pVAX1-P33-P23的构建及在Hela细胞中的表达

作　者: 李娟
导　师: 许应天
学　校: 延边大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛瑟氏泰勒虫 P33-P23融合基因核酸疫苗
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 9次
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内容摘要

牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)寄生于牛红细胞和淋巴细胞而引起的一种血液原虫病。近些年,瑟氏泰勒虫病的发生呈上升趋势,给相关国家的畜牧业带来了较大的经济损失,引起了国内外兽医界的广泛关注。由于经贸活动的频繁和养牛业的规模化,该病的流行区逐渐扩大,特别是该病对外地引进牛、纯种牛和改良杂种牛的危害大,已成为严重影响养牛业的疾病之一。据报道T.sergenti梨浆虫表面蛋白P23表达于瑟氏泰勒虫裂殖子膜表面,P33主要表面蛋白基因序列中的C末端有疏水的膜固着点,N末端有信号肽序列,并且都具有很好的免疫原性。本研究根据GenBank牛瑟氏泰勒虫P33和P23表面蛋白基因序列,分别设计了两对特异性引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取了牛瑟氏泰勒虫基因组DNA,克隆出了大小为849bp的P33部分基因片段和669 bp的P23部分基因片段,一同连入真核表达载体pVAX1上,两个片段之间用Linker序列连接,经过酶切和PCR鉴定,结果成功地构建了含有目的基因片段的核酸疫苗重组表达质粒pVAX1-P33-P23。通过Hela细胞转染和G418筛选方法,SDS-PAGE鉴定结果为表达出约55 kDa的P33-P23融合蛋白。Westernblotting检测结果表明,该融合蛋白可被牛瑟氏泰勒虫阳性血清识别,并具有较好的反应原性,为下一步核酸疫苗的研究奠定了坚实的基础。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-18
  1 瑟氏泰勒虫病概况  10-11
  2 牛瑟氏泰勒虫病防治措施的研究进展  11-12
  3 病原学方面的研究  12-13
  4 诊断方法的研究进展  13-15
  5 寄生虫核酸疫苗的研究进展  15-17
  6 本课题的研究目的和意义  17-18
试验研究  18-32
  1 材料  18-22
    1.1 血液来源:  18
    1.2 菌种和载体:  18
    1.3 试剂:  18
    1.4 主要仪器:  18
    1.5 主要试剂的配制:  18-22
  2 试验方法  22-32
    2.1 引物设计与合成  22-23
    2.2 全血中DNA基因组的提取  23
    2.3 目的基因的PCR扩增  23-24
    2.4 DH5α感受态细胞的制备  24-25
    2.5 pMD18-T-P33和pMD18-T-P23重组质粒的构建  25-26
    2.6 pVAX1-P33-P23真核表达重组质粒构建  26-27
    2.7 重组质粒表达产物的检测  27-32
结果  32-40
  1.P33和P23基因的PCR扩增  32
  2.pMD18-T-P33和pMD18-T-P23重组质粒的鉴定和核苷酸序列的测定  32-36
  3.pVAX1-P33-P23融合基因重组质粒的鉴定  36-38
  4.SDS-PAGE分析  38-39
  5.Western blotting分析  39-40
讨论  40-42
结论  42-43
参考文献  43-50
致谢  50

牛瑟氏泰勒虫pVAX1-P33-P23的构建及在Hela细胞中的表达

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