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多基因转化741杨及其基因表达的初步研究

作　者: 张淑娟
导　师: 杨敏生
学　校: 河北农业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: Ri质粒 741杨多基因转化形态变异植物内源激素 Bt毒蛋白
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本文是在田颖川和郑钧宝等研究的转双抗虫基因741杨基础上,成功的转化了Ri质粒15834菌株,并以转双抗虫基因741杨和741杨单转Ri质粒15834菌株为对照,研究多基因的转化以及初步探讨了多基因之间的基因表达。通过rolD基因和MAS基因,NptⅡ基因和BtCry1Ac基因的PCR检测和外部形态差异对转多基因植株进行鉴定,表明多基因共存于转基因植株中。 1.对转多基因741杨各株系试管苗的生根率、根长、根量、高生长量及叶片及茎形态变异进行研究,得出大多数转多基因741杨表现出Ri质粒转化植物的典型特征,转化植株的叶片均在MS₀培养基上具有自发根的特性,形态表现为叶片皱缩、茎生长量减少,试管苗生根率高,侧根极为发达等特点。98%左右转基因株系的生根率比对照植株都有明显提高;转多基因株系的根数量比对照都有增加,根发达,形成簇生根,多得几乎无法计数;根长度大多数株系明显高于对照,有少数的株系与对照植株相似,有部分株系的根长明显短于对照;多基因转化741毛白杨后,引起转化植株叶片增厚,叶面积明显缩小,叶柄变短,叶面皱缩;茎节间缩短,苗高生长减少,分枝数量增加,个别株系出现茎弯曲生长,严重影响了苗木的正常生长,但是有少量株系的植株出现了正常生长的情况,甚至对生长有一定促进作用。 2.通过HPLC法对转多基因741杨不同株系的植株叶片的内源激素进行了测定。几乎所有转多基因741杨株系中,植株叶片中内源IAA含量均高于转双抗虫基因741杨,植株生长表现越矮小的叶片中IAA含量越高,大部分株系比741杨单转Ri质粒15834菌株对照含量低。 3.采用ELISA技术,对转多基因741杨不同株系转基因苗和毛状根中Bt毒蛋白进行测定,结果表明Bt毒蛋白在叶片和毛状根中均有表达,叶片毒蛋白表达量明显高于毛状根的。转多基因苗中不论是其叶片还是毛状根,其毒蛋白含量大部分株系均比转双抗虫基因741杨的毒蛋白含量低,比单转Ri质粒15834菌株的含量高。表明转入发根农杆菌后,其原来根癌农杆菌毒蛋白表达含量降低了。发根农杆菌的转入对根癌农杆菌中的毒蛋白含量有一定的影响,其增加和降低将会对组培苗体内的各个指标有一定的影响,尤其会影响植物的生长发育。而植物激素含量恰恰是这一影响的一个具体表现,反过来又会影响植物的生长发育,进而再影响到的毒蛋白残留与降解的变化。

全文目录

1 引言  10-20
  1.1 杨树BT抗虫基因工程  10-11
    1.1.1 Bt毒蛋白杀虫机理和Bt毒蛋白基因的分类  10-11
    1.1.2 杨树Bt抗虫基因工程的研究进展  11
  1.2 发根农杆菌概况  11-14
    1.2.1 发根农杆菌和Ri质粒  11-12
    1.2.2 农杆菌转化机制  12-13
    1.2.3 发根农杆菌Ri质粒致病机理  13-14
    1.2.4 发根农杆菌研究进展  14
  1.3 影响发根农杆菌诱导毛状根形成的因素  14-16
    1.3.1 菌株  14-15
    1.3.2 外植体  15
    1.3.3 化学因子  15
    1.3.4 物理因子  15-16
  1.4 毛状根遗传转化的特性  16
  1.5 再生植株的鉴定  16
  1.6 毛状根的应用  16-17
  1.7 转发根农杆菌RI质粒T-DNA对内源激素的影响  17-18
  1.8 问题提出  18-20
    1.8.1 转双抗虫基因741杨  18
    1.8.2 实验目的  18-20
2 RI质粒15834对转双抗虫基因741杨的转化  20-32
  2.1 材料、仪器、设备  20-21
    2.1.1 植物材料  20
    2.1.2 发根农杆菌菌株  20
    2.1.3 培养基  20-21
    2.1.4 重要试剂、酶  21
    2.1.5 重要仪器设备  21
  2.2 研究方法  21-23
    2.2.1 发根农杆菌菌种的保存与活化  21
    2.2.2 发根农杆菌菌液制备  21-22
    2.2.3 农杆菌介导的遗传转化  22
    2.2.4 影响农杆菌转化的因素  22
    2.2.5 毛状根的扩繁  22-23
    2.2.6 毛状根再生完整植株  23
  2.3 转化植株的PCR检测  23-25
    2.3.1 DNA的提取  23
    2.3.2 农杆菌质粒提取  23-24
    2.3.3 引物设计  24
    2.3.4 PCR扩增条件  24-25
  2.4 结果与分析  25-30
    2.4.1 农杆菌介导转化因素的确定  25-27
    2.4.2 毛状根进一步培养扩繁  27-28
    2.4.3 毛状根植株再生  28
    2.4.4 PCR检测结果  28-30
  2.5 讨论与小结  30-32
3 多基因转化741杨形态变化的研究  32-38
  3.1 材料与方法  32
    3.1.1 材料  32
    3.1.2 实验方法  32
  3.2 结果与分析  32-37
    3.2.1 转多基因741杨各株系试管苗的形态变异  32-34
    3.2.2 转多基因741杨各株系试管苗生根率的变化  34-35
    3.2.3 转多基因741杨各株系试管苗发根数量的变化  35-36
    3.2.4 转多基因741杨各株系试管苗高生长量的差异  36-37
  3.3 讨论与小结  37-38
4 转多基因741杨各株系试管苗内源激素测定  38-42
  4.1 材料和方法  38-39
    4.1.1 主要仪器和试剂  38
    4.1.2 色谱条件  38-39
    4.1.3 内源激素的提取、纯化  39
  4.2 结果与分析  39-40
    4.2.1 不同转多基因741杨株系之间内源IAA含量变化  39-40
    4.2.2 不同转多基因741杨株系之间内源GA含量变化  40
  4.3 讨论与小结  40-42
5 转多基因741杨试管苗和发状根BT毒蛋白的测定  42-46
  5.1 ELISA试剂盒检测  42
  5.2 试验方法  42-44
  5.3 结果与分析  44-45
    5.3.1 不同转多基因741杨株系叶片的Bt毒蛋白含量变化  44-45
    5.3.2 不同转多基因741杨株系毛状根的Bt毒蛋白含量变化  45
  5.4 讨论与小结  45-46
6 讨论  46-48
7 结论  48-49
参考文献  49-55
附录  55-56
在读期间发表的学术论文  56-57
作者简介  57-58
致谢  58

多基因转化741杨及其基因表达的初步研究

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