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乙型肝炎病毒X蛋白真核表达及对巨噬细胞分泌功能与凋亡的影响

作　者: 王静
导　师: 万艳平
学　校: 南华大学
专　业: 病原生物学
关键词: 乙型肝炎病毒 X基因 巨噬细胞 细胞因子 凋亡
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


目的：将乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）X蛋白真核表达载体pcDNA3.1（+）-HBx转染巨噬细胞，观察X蛋白在细胞中的表达及其对巨噬细胞分泌细胞因子及凋亡的影响，为进一步研究HBV的致病机制奠定实验基础。 方法：用Primer 5.0软件分析HBV X基因序列，设计相应特异性引物，聚合酶链反应（PCR）扩增465bp的目的基因片段，将其插入pcDNA3.1（+）载体，通过双酶切分析及测序鉴定筛选阳性重组体；将真核表达载体pcDNA3.1（+）-HBx通过Super FectTM脂转染试剂转染巨噬细胞，利用Western-blotting鉴定X蛋白在巨噬细胞中的表达；细胞转染质粒后24h，用LPS刺激巨噬细胞，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测pcDNA3.1（+）-HBx转染的巨噬细胞不同时间（12h、24h、48h）培养上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β的含量，统计软件SPSS 13.0分析所得数据；通过形态学方法观察巨噬细胞，利用显微计数法测定X蛋白即时高表达时，地塞米松诱导的细胞凋亡并计算凋亡率，用统计软件通过方差分析所得数据。 结果： （1）将PCR扩增的465bp大小的HBV X基因片段，连接入pcDNA3.1（+），双酶切及测序结果表明X基因亚克隆入pcDNA3.1（+）真核表达载体，即得X蛋白真核表达载体pcDNA3.1（+）-HBx。 （2）将真核表达载体pcDNA3.1（+）-HBx转染巨噬细胞，Western-blotting结果显示pcDNA3.1（+）-HBx能在巨噬细胞中表达约17KD的目的蛋白。 （3）ELISA法测定细胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量，LPS刺激组及pcDNA3.1（+）组与空白对照组有显著性差异（P＜0.01），pcDNA3.1（+）-HBx组与LPS刺激组及pcDNA3.1（+）组有显著性差异（P＜0.01），而LPS刺激组与pcDNA3.1（+）组无显著性差异（P＞0.05），即LPS可活化巨噬细胞分泌细胞因子，且X蛋白即时高表达可引起LPS诱导的巨噬细胞

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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