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氯霉素酶促化学发光免疫分析方法的建立

作　者: 林斯
导　师: 韩世泉；刘一兵
学　校: 中国原子能科学研究院
专　业: 核技术及应用
关键词: 氯霉素化学发光免疫分析辣根过氧化物酶鲁米诺
分类号: TS207.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 274次
引　用: 7次
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内容摘要

采用竞争法,即待测样品中的氯霉素与标记有辣根过氧化物酶的氯霉素竞争结合固相兔抗氯霉素抗体这一基本原理,利用鲁米诺体系作为化学发光底物,高灵敏地测定动物性食品中的氯霉素残留量。将动物性食品预处理后加入包被有兔抗氯霉素抗体的白色发光板微孔中,氯霉素酶标记物和样品中的氯霉素竞争与固相抗体结合。反应结束后加入化学发光底物并检测发光计数,通过标准曲线求得样品浓度。在化学发光免疫分析技术中,化学发光底物的制备是关键技术之一。制备的发光底物具有发光持续稳定、信噪比高、本底低、发光峰值适中的特点。在与进口化学发光底物进行的平行比较实验中发现两者各有所长,性能相当。固相抗体包被浓度为3μg/ml,酶标记物工作液稀释度为1:10000,每孔加待测样品或标准品100μl和酶标记物工作液50μl,在37℃下反应1h,洗涤后每孔加发光底物180μl,3mins后在发光检测仪下检测发光计数。该方法学灵敏度为0.046ng/ml,批内变异系数小于8%,批间变异系数小于20%。方法学回收率为87.4～101%,稀释实验相关方程为y=4.015x-0.120,相关系数为0.999。标准曲线的线性范围为0.05～10ng/ml。该方法与德国R-Biopharm的氯霉素酶联免疫分析方法的方法学比较实验中,相关方程为y=0.996x+0.144,相关系数为0.987。该方法克服了食品安全检测时动物性食品中的杂质影响发光持续性的问题,使得化学发光免疫分析技术得以在食品安全分析领域应用。使用该方法可以在短时间内出结果,具有快速、简便、高灵敏度等的特点。

全文目录

一．引言  9-13
  1．1 氯霉素化学发光免疫分析药盒的研制背景  9-11
    1．1．1 对氯霉素检测的意义  9-10
    1．1．2 酶促化学发光免疫分析方法的研究意义  10-11
  1．2 竞争化学发光免疫分析的基本原理  11-12
  1．3 国内外现状  12-13
二．实验部分  13-19
  2．1 实验材料  13
    2．1．1 试剂与材料  13
    2．1．2 仪器设备  13
  2．2 实验方法  13-14
    2．2．1 兔抗氯霉素多抗的纯化  13
    2．2．2 氯霉素的酶标记及其纯化  13-14
    2．2．3 分析方法及步骤  14
  2．3 酶标记物稀释度的选择  14
  2．4 抗体包被浓度的选择  14
  2．5 反应时间的选择  14-15
  2．6 化学发光底物液的制备  15-16
    2．6．1 化学发光底物液缓冲体系的选择  15
    2．6．2 化学发光底物的发光增强剂类型选择  15
    2．6．3 化学发光增强剂浓度的选择  15
    2．6．4 鲁米诺浓度的选择  15
    2．6．5 氧化剂浓度的选择  15-16
  2．7 化学发光底物液的发光性能鉴定  16
    2．7．1 化学发光底物液的发光持续性实验  16
    2．7．2 本发光底物与进口发光底物(Roche公司产品)性能比较  16
  2．8 比较三种化学发光板的性能  16
  2．9 方法学鉴定  16-18
    2．9．1 分析灵敏度  16
    2．9．2 分析精密度  16-17
    2．9．3 各种动物性食品预处理方法  17
    2．9．4 稀释实验(以奶样为例)  17
    2．9．5 奶样分析回收率  17
    2．9．6 牛奶、鸡蛋、鸡肉、蜂蜜、血清、虾等动物性样品的回收实验  17
    2．9．7 与 R-Biopharm公司氯霉素酶联免疫分析试剂盒的比较  17-18
  2．10 方法学各主要试剂组分的稳定性  18
    2．10．1 酶标记物稳定性实验  18
    2．10．2 标准品稳定性实验  18
    2．10．3 包被板稳定性实验  18
    2．10．4 化学发光底物液的稳定性  18
  2．11 自配化学发光底物在其他方面的应用  18-19
三．实验结果  19-39
  3．1 氯霉素酶标记物的制备  19
  3．2 氯霉素标记物稀释度的选择  19-20
  3．3 抗体包被浓度的选择  20-21
  3．4 反应时间的选择  21-22
  3．5 氯霉素酶联免疫分析的标准曲线  22
  3．6 化学发光底物的制备  22-26
    3．6．1 化学发光底物液缓冲体系的选择  22-23
    3．6．2 化学发光底物的发光增强剂类型选择  23-24
    3．6．3 化学发光增强剂浓度的选择  24-25
    3．6．4 鲁米诺浓度的选择  25-26
    3．6．5 氧化剂浓度的选择  26
  3．7 化学发光底物液的发光性能鉴定  26-31
    3．7．1 化学发光增强液的发光持续性实验  26-29
    3．7．2 自配发光底物与进口发光底物(Roche公司产品)性能比较  29-30
    3．7．3 比较三种化学发光板的性能  30-31
  3．8 氯霉素酶促化学发光免疫反应标准曲线  31
  3．9 方法学鉴定  31-34
    3．9．1 分析灵敏度  31
    3．9．2 分析精密度  31-32
    3．9．3 稀释实验(以奶样为例)  32-33
    3．9．4 奶样分析回收率  33
    3．9．5 牛奶、鸡蛋、鸡肉、蜂蜜、血清、虾等动物性样品的回收实验  33-34
    3．9．6 与 R-Biopharm氯霉素酶联免疫分析试剂盒的比较  34
  3．10 本方法学各主要试剂组分的稳定性  34-38
    3．10．1 标记物稳定性实验  34-36
    3．10．2 标准品稳定性实验  36
    3．10．3 包被板稳定性实验  36-37
    3．10．4 化学发光底物液的稳定性  37-38
  3．11 自配化学发光底物在其他方面应用  38-39
    3．11．1 自配化学发光底物在促甲状腺素(TSH)检测上的应用  38
    3．11．2 自配化学发光底物在甲胎蛋白检测上的应用  38-39
四．讨论  39-42
  4．1 化学发光增强剂类型的选择  39-40
  4．2 发光底物液的缓冲体系选择  40
  4．3 发光底物主要组分浓度的选择  40-41
  4．4 化学发光底物液的发光性能鉴定  41-42
  4．5 检测样品中杂质对化学发光干扰的消除  42
  4．6 主要试剂的稳定性实验  42
五．结论  42-44
参考文献  44-49
致谢  49

氯霉素酶促化学发光免疫分析方法的建立

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