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柚类柑橘衰退病毒（CTV）强、弱毒分离株的分子鉴定

作　者: 宋震
导　师: 周常勇
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 柑橘衰退病毒(CTV) 限制性片段长度多态性(RFLP) 双向RT-PCR(BD-PCR) 序列分析分子鉴定弱毒株交叉保护(MSCP)
分类号: S436.66
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)是线形病毒科线形病毒属的一种,严重威胁着世界的柑橘生产。在我国,CTV及其强力传媒褐色橘蚜(Toxoptera citricida Kirkaldy)广泛分布。目前,我国柚类栽培面积和产量均居世界首位,经济效益显著,发展前景广阔。但由于柚类优良品种及其砧木多对CTV敏感,随着柚类栽培面积的不断扩大,茎陷点型衰退病的危害呈日益严重趋势。依据国外经验,在CTV强毒系及橘蚜并存的地区,应用弱毒系交叉保护(MSCP)是保证感病品种生产的最有效措施。因此,了解CTV在我国柚类上的发生及株系分布情况,筛选和鉴定有代表性的CTV强、弱毒分离株,尽快为弱毒系交叉保护的应用奠定基础,对保证我国柚类产业的健康发展具有十分重要的意义。本研究应用直接组织印迹免疫(DTBIA)对不同地区不同品种的450个柚类样品进行了CTV检测;在此基础上,应用RT-PCR、RFLP、BD-PCR对126个柚类CTV分离株进行了初步的鉴定分析;对6个代表性的分离株做了指示植物鉴定和单蚜传毒分离纯化,并对所获得的29个单蚜分离株做了RFLP、BD-PCR、SSCP分析;对6个CTV柚单蚜分离株和2个代表性的CTV柚分离株做了p25、p23两个基因的序列测定并与澳大利亚CTV弱毒分离株PB61及目前世界上已全长测序的CTV分离株T30、T36、T385、SY568、VT、NUAGA的相应序列进行了比对分析。主要结论如下: 1.CTV柚分离株以单一的p25/Hinfl RFLP组群为主,占样品总量的83.3%,其中p25/Hinfl RFLP组群6样品的检出率为69.8%,是目前我国柚类上的优势流行株系。 2.84.1%的CTV柚分离株的p23/BD-PCR产物仅出现一条612bp的特异条带,而未产生与CTV弱毒系相联系的239bp条带及与CTV强毒系相联系的450bp的特征条带。 3.在p25/Hinfl RFLP分析、p23/BD-PCR鉴定以及p23、p25两个基因的序列分析中,CTV分离株S051、S052与弱毒株PB61、T30、T385的表现相应一致,并且在指示植物鉴定中表现为弱毒CTV侵染特征。 4.CTV柚分离株S053、S054、S055、S056、S057和S058的p25/Hinfl RFLP组群为6,p23/BD-PCR产物仅出现一条612bp的特异条带,p23、p25两个基因的同源性与CTV分离株T30、T36、T385、SY568、VT、NUAGA、PB61较远并在系统发生树上聚为单独一簇,可能是中国特有株系。 5.p25/Hinfl RFLP与p23/BD-PCR结合使用对于CTV弱毒株的快速鉴定具有参考价值。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-8
缩略符号表  8-11
第一章绪论  11-20
  1.1 研究背景、目的和意义  11-12
    1.1.1 柚类重要性  11
    1.1.2 柑橘衰退病毒(CTV)的分布及危害  11-12
    1.1.3 CTV防治策略与弱毒系交叉保护(MSCP)  12
  1.2 国内外研究现状  12-19
    1.2.1 CTV分类学地位  12-13
    1.2.2 CTV理化特性  13
    1.2.3 CTV生物学特性  13-14
    1.2.4 CTV分子生物学特性  14-15
    1.2.5 CTV的株系鉴定  15-19
  1.3 小结  19-20
第二章材料与方法  20-25
  2.1 供试材料  20-21
    2.1.1 样品采集  20
    2.1.2 供试昆虫  20
    2.1.3 供试苗木  20
    2.1.4 供试试剂  20-21
    2.1.5 实验仪器  21
  2.2 试验方法  21-25
    2.2.1 直接组织印迹免疫(DTBIA)检测  21
    2.2.2 毒源保存  21-22
    2.2.3 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测  22
    2.2.4 限制性片段长度多态性(RFLP)分析  22
    2.2.5 双向逆转录-聚合酶链式反应(BD-PCR)分析  22-23
    2.2.6 单蚜传毒纯化  23-24
    2.2.7 序列测定与分析  24
    2.2.8 指示植物鉴定  24-25
第三章结果与分析  25-38
  3.1 直接组织印迹免疫(DTBIA)检测  25-26
  3.2 毒源保存  26-27
  3.3 p25／RT-PCR检测  27
  3.4 CTV柚分离株的p25／Hinf1 RFLP分析  27-29
  3.5 CTV柚分离株的p23／BD-PCR分析  29-31
  3.6 单蚜传毒纯化  31-33
    3.6.1 单蚜传毒结果  31
    3.6.2 纯化结果分析  31-33
  3.7 序列测定及分析  33-37
    3.7.1 RT-PCR反转录及纯化结果  33
    3.7.2 p25序列测定结果及分析  33-34
    3.7.3 p23序列测定结果及分析  34-37
  3.8 指示植物鉴定结果  37-38
第四章结论与讨论  38-42
  4.1 结论  38
  4.2 讨论  38-42
参考文献  42-49
附录  49-55
  1.常用缓冲液及储备液  49-50
  2.p25序列测定结果  50-52
  3.p23序列测定结果  52-55
致谢  55-56
作者简历  56

柚类柑橘衰退病毒（CTV）强、弱毒分离株的分子鉴定

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