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胚胎干细胞分化神经细胞特性及分化机制的研究

作　者: 陈良强
导　师: 郑筱祥
学　校: 浙江大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 胚胎干细胞 体外培养 定向诱导分化 神经前体细胞 神经细胞 NMDA受体 功能特性 分化机制
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


干细胞研究在人类生命科学中具有重要的基础研究意义,在人类健康和生命质量领域具有广泛的应用前景。胚胎干细胞来源于受精卵发育早期胚胎的内细胞团,具有发育的全能性,可以分化为体内所有类型的成熟细胞。在发育生物学、细胞治疗、组织器官工程等研究和开发中具有巨大的潜力。 为了全面认识ES细胞的特性并为今后进行转基因动物、组织工程研究做好铺垫,我们进行了小鼠ES细胞的建系研究,以ICR种和昆明种小鼠为实验对象,采用超数排卵的方法获得孕3.5d小鼠囊胚,培养在用丝裂霉素C处理过的MEF细胞饲养层上,选取适当时间离散增殖的ICM和类ES细胞集落,分析了在小鼠ES细胞建系过程中,饲养层细胞、消化液及不同品系来源的胚胎的影响。结果,ICR小鼠和昆明小鼠两种来源的饲养层细胞对胚胎贴壁、ICM增殖无影响;消化液浓度和作用时间对ICM的影响明显,以较低浓度的胰酶和EDTA消化为宜;另外,血清质量、培养板质量等因素可能影响建系。 为了探讨小鼠胚胎干细胞分化神经细胞的功能特性,及其分化过程中N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体的表达情况,我们利用全反式维甲酸（RA）诱导胚胎干细胞拟胚体定向分化为神经细胞,用摄像相差显微镜观察分化神经细胞的形态,用免疫细胞化学方法鉴定分化神经细胞表达特异性抗原,用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测分化神经细胞Calbindin D28K和NMDA受体（NR）亚型mRNA的表达情况,用荧光共聚焦显微镜检测分化神经细胞在NMDA刺激下胞内游离Ca2+浓度的变化。结果显示,1×10-6mol/LRA的培养基诱导培养ES细胞拟胚体4天,在拟胚体周围出现大量神经样细胞,分化神经细胞的比率与拟胚体的大小有关;撤除RA继续培养4d后可以检测到NR2B mRNA的转录,NR2C有弱的转录;在第6d后NR2A有转录;在第8d及其之后NR1的转录出现。撤除RA继续培养8天后在拟胚体周围出现大量神经样细胞;RT-PCR检测显示有Calbindin D28和NR1、NR2A、NR2B、NR2C mRNA的转录;在NMDA刺激下胞内游离Ca2+浓度明显升高（P<0.01）。提示,用RA诱导ES细胞分化的神经细胞NMDA受体亚型的表达与中枢神经发育过程中神经细胞NMDA受体亚型的表达具有一定的相似性。用RA诱导ES细胞分化的神

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
第一章 概论  8-29
  第一节 干细胞研究概述  8-16
    1．成体干细胞  8-9
    2．成体干细胞的生物学特点  9-10
    3．脐血干细胞  10
    4．骨髓基质干细胞与骨髓间充质干细胞  10-11
    5．脂肪间充质干细胞  11-12
    6．皮肤干细胞  12-13
    7．造血干细胞  13
    8．成体干细胞组织工程  13-16
  第二节 胚胎干细胞  16-24
    1．胚胎发育与胚胎干细胞研究简述  16-18
    2．胚胎干细胞的研究历史  18-19
    3．ES细胞的特性  19-20
    4．胚胎干细胞建系  20
    5．ES细胞分化各种成体细胞的特性  20-21
    6．ES细胞的应用前景  21-24
  第三节 小鼠胚胎干细胞定向诱导分化神经细胞  24-27
    1．ES细胞的培养和分化  24-25
    2．ES细胞向神经细胞定向诱导分化  25
    3．无血清条件培养ES细胞定向诱导分化神经细胞  25-27
  本课题的研究自的和意义  27-29
第二章 小鼠胚胎干细胞建系及其特性的研究  29-42
  第一节 前言  29-30
  第二节 材料和方法  30-37
    1．材料  30-31
    2．试剂配制  31-32
    3．仪器  32
    4．MEF细胞的原代分离和培养  32-33
    5．小鼠ES细胞的分离和培养  33-35
    6．小鼠ES细胞的鉴定  35-37
  第三节 实验结果  37-40
    1．两种小鼠得胚率、贴壁比率  37
    2．小鼠胚胎分离和贴壁过程  37-40
  第四节 分析与讨论  40-42
    1．饲养层细胞对胚胎贴壁和增殖的影响  40
    2．种系和季节对得胚率和胚胎贴壁增殖率的影响  40-41
    3．获取ICM方法、消化液浓度和作用时间的选择  41-42
第三章 胚胎干细胞定向诱导分化神经细胞及其特性的研究  42-56
  第一节 前言  42-43
  第二节 ES细胞诱导分化神经细胞  43-49
    1．材料  43-44
    2．仪器  44-45
    3．方法  45-49
      3．1．小鼠ES细胞的培养  45
      3．2．EBs的培养  45-46
      3．3．不同浓度RA诱导分化神经细胞  46
      3．4．不同大小的EBs诱导分化神经细胞  46-47
      3．5．撤除RA后时间序列上分化神经细胞  47
      3．6．分化神经细胞的免疫细胞化学检测  47
      3．7．RT-PCR检测分化神经细胞特异性mRNA转录  47-49
      3．8．NMDA刺激下分化神经细胞内钙离子的变化  49
  第三节 实验结果  49-54
    1．胚胎干细胞、拟胚体、分化后免疫细胞化学检测  49-50
    2．ES细胞分化为神经样细胞的比率  50-51
    3．分化后时间序列上神经样细胞NMDA受体亚型表达的检测  51-53
    4．分化神经细胞Calbindin D28、NMDA受体亚型表达的检测  53
    5．分化神经细胞NMDA受体的活性的检测  53-54
  第四节 分析与讨论  54-56
第四章 胚胎干细胞分化神经细胞信号转导机制的研究  56-67
  第一节 维持ES细胞不分化状态的机制  56-61
    1．维持ES细胞不分化的因素  56-57
    2．维持ES细胞不分化的信号转导机制  57-61
      2．1．LIF受体及信号转导机制  57-59
      2．2．ES细胞中Oct-3／4的功能及其表达的调控  59-60
      2．3．BMP／Smad／Id信号通路  60
      2．4．LIF／STAT3与BMP／Smad／Id信号通路的协同作用  60-61
  第二节 RA诱导ES细胞分化神经细胞的机制  61-67
    1．RA受体  61-62
    2．RA信号转导  62-66
    3．讨论  66-67
第五章 总结与展望  67-71
  第一节 研究工作总结  67-68
  第二节 展望  68-71
相关论文发表情况  71-72
参考文献  72-79
致谢  79

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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