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香蕉、番木瓜和芒果NBS-LRR类和STK类抗病基因同源序列的克隆和特征分析

作　者: 徐兵强
导　师: 黄俊生；杜中军
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 香蕉番木瓜芒果 R基因抗病基因同源序列抗病基因同源序列克隆法
分类号: S668.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 343次
引　用: 3次
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内容摘要

植物抗病基因(Resistance Gene,R)产物存在保守结构域,如NBS、LRR、STK、TIR、TM和LZ等。根据这些保守序列设计简并引物寻找R基因同源序列(Resistance Gene Analogs,RGA)的方法称为RGA法。现已在多种植物中分离到了许多RGAs。有的是R基因,有的是抗病候选基因。这不仅预示了植物R基因抗病的可能机理,也为R基因的克隆提供了新途径。所获得的RGAs不但可发展为植物R基因的更精确定位的分子标记,而且有可能广泛应用于包括多年生果树在内的作物R基因的克隆策略中。该方法已在苹果、柑桔等遗传背景复杂的多年生果树上得到成功应用。因此,利用该法克隆热带果树RGAs,对分子标记辅助育种具有重大意义,并为克隆热带果树R基因、深入理解三种热带果树中R基因的结构和功能奠定了基础。本研究是根据已知植物R基因NBS-LRR和STK保守序列分别设计简并引物,利用PCR和RT-PCR技术从香蕉、番木瓜和芒果嫩叶组织中扩增出RGAs,并对其中部分RGAs的碱基序列及其编码的氨基酸序列进行了分析。同时利用3’RACE技术对番木瓜的cPK2进行了扩增。主要结果如下: 1.根据已知植物R基因NBS-LRR和STK保守序列各设计4对简并引物,采用PCR和RT-PCR技术对香蕉、番木瓜和芒果基因组DNA和cDNA进行了扩增,获得了以500bp为主带的电泳图。回收约500bp条带,连接转化和测序。 2.从香蕉cDNA和番木瓜基因组DNA分别获得1个(B-BNS)和2个NBS-LRR类RGAs序列。它们都具有典型的NBS-LRR催化保守结构域,如磷酸结合环(P-loop,Kinase-1a,(G/P)GXGKTT(a/T))、Kinase-2a(K(K/R)XaaaaDDV(W/D)K)、Kinase-3a(GS-RaaaT(T/S)R)和下游的疏水结构域(HD,GLPLAL),与已知部分R基因(水稻Xal、烟草N、番茄12C-2、拟南芥RPM1和RPS2、番茄Prf)产物的NBS保守结构域具有较高的相似性。但是没有从芒果中得到NBS-LRR类RGA带,可能是由于芒果的R基因比较特殊,没有与实验引物相似的R基因序列,可能需要进一步设计另类简并引物来扩增;或者可能是由于芒果的品种问题。 3.从香蕉、番木瓜和芒果基因组DNA分别获得7条、5条和6条STK类RGAs序列,从番木瓜cDNA获得4条STK类RGAs序列。除番木瓜gPK5外,所有RGAs序列都含有STK保守区的DaKXXN和GTaGYXAP(N/E)等亚保守域,与已知部分R

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
1 前言  10-24
  1.1 植物抗病性研究进展  10-19
    1.1.1 植物抗病性反应  10-12
    1.1.2 R基因的克隆  12-14
    1.1.3 NBS-LRR类R基因结构与功能关系  14-18
      1.1.3.1 NBS保守基序及功能  15
      1.1.3.2 LRR保守基序及功能  15-17
      1.1.3.3 TIR保守基序及功能  17
      1.1.3.4 CC和LZ保守基序及功能  17-18
    1.1.4 STK类R基因结构与功能的关系  18-19
    1.1.5 R基因介导的抗病信号传导  19
      1.1.5.1 无毒基因互作识别产生信号  19
      1.1.5.2 R基因介导信号传导过程  19
  1.2 R基因同源序列的研究进展  19-22
  1.3 植物R基因的起源与进化  22-23
  1.4 果树R基因的研究现状  23
  1.5 本研究的目标与内容  23-24
    1.5.1 研究目标  23
    1.5.2 研究内容  23-24
2 材料与方法  24-31
  2.1 材料  24
  2.2 方法  24-31
    2.2.1 引物的设计  24-25
      2.2.1.1 NBS-LRR类R基因的引物设计  24
      2.2.1.2 STK类R基因的引物设计  24-25
    2.2.2 香蕉、番木瓜和芒果基因组DNA的提取  25-26
    2.2.3 PCR扩增  26
    2.2.4 总RNA的提取及RT-PCR  26-28
      2.2.4.1 香蕉和番木瓜总RNA的提取  26-27
      2.2.4.2 芒果总RNA的提取  27
      2.2.4.3 cDNA的合成  27-28
      2.2.4.4 PCR扩增  28
    2.2.5 特异带的回收  28
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  28-29
    2.2.7 回收条带的克隆  29
      2.2.7.1 连接  29
      2.2.7.2 转化大肠杆菌  29
    2.2.8 质粒DNA的提取及菌落PCR检测  29-31
      2.2.8.1 质粒DNA的提取(碱裂解法)  29-30
      2.2.8.2 菌落PCR鉴定  30-31
    2.2.9 DNA测序及序列分析  31
    2.2.10 利用RACE技术扩增番木瓜cPK2的末端  31
3 结果与分析  31-50
  3.1 总RNA的提取  31-32
  3.2 特异PCR产物  32
  3.3 RGA的分离、克隆及分析  32-49
    3.3.1 香蕉RGAs的分离、克隆及分析  32-38
      3.3.1.1 STK类RGAs的分离、克隆及分析  32-35
        3.3.1.1.1 STK类RGAs的分离和克隆  32
        3.3.1.1.2 STK类RGAs的分析及与已知R基因的比较  32-35
      3.3.1.2 NBS-LRR类RGAs的分离、克隆及分析  35-38
        3.3.1.2.1 NBS-LRR类RGAs的分离和克隆  35
        3.3.1.2.2 NBS-LRR类RGAs的分析及与已知R基因的比较  35-38
    3.3.2 番木瓜RGAs的分离、克隆及分析  38-45
      3.3.2.1 STK类RGAs的分离、克隆及分析  38-42
        3.3.2.1.1 STK类RGAs的分离与克隆  38-39
        3.3.2.1.2 STK类RGAs的分析及与已知R基因的比较  39-42
      3.3.2.2 NBS-LRR类RGAs的分离、克隆及分析  42-45
        3.3.2.2.1 NBS-LRR类RGAs的分离与克隆  42
        3.3.2.2.2 NBS-LRR类RGAs的分析及与已知R基因的比较  42-45
    3.3.3 芒果STK类RGAs的分离、克隆及分析  45-49
      3.3.3.1 STK类RGAs的分离与克隆  45-46
      3.3.3.2 STK类RGAs的分析及与已知R基因的比较  46-49
  3.4 利用3′RACE获得的cPK23′端序列  49-50
    3.4.1 拼接后片段的初步分析  49
    3.4.2 该片段在NCBI上保守结构域的分析0  49-50
4 讨论  50-54
  4.1 材料的选择  50-51
  4.2 已获得RGAs的可能功能和意义  51-53
  4.3 RGAs功能的进一步研究  53-54
5 结论  54-57
参考文献  57-67
缩略语表  67-68
附录  68-72
致谢  72

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类 > 香蕉
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