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小麦Mlo基因RNAi表达载体的构建和反义表达植株后代的分子检测

作　者: 吴莹莹
导　师: 赵双宜
学　校: 山东大学
专　业: 遗传学
关键词: 小麦 白粉病 Mlo基因 RNA干扰 反义 农杆菌介导的苗端转化 巢式PCR
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


小麦白粉病是由专性寄生真菌—小麦白粉菌（Erysiphe graminis f．sp．Tritici）引起的一种全球性危害小麦的严重病害，对小麦的产量和品质有着极大的影响。施用农药虽然能在一定程度上减轻病害，但却严重危害生态环境和产品。白粉菌生理小种众多，变异速度很快，常规育种获得的小麦抗性品种往往因为白粉菌生理小种的变异而失去抗性，这就大大缩短了品种的使用年限，因此利用基因工程方法选育广谱抗白粉病品种可能是最为经济和有效的方法。研究表明大麦Mlo基因的隐性突变mlo可以使大麦对几乎所有已知大麦白粉病菌（Erysiphe graminis f．sp．hordei）生理小种产生持久、广谱的抗病性。小麦是大麦的近缘种，而且二者的Mlo基因的cDNA有92％的同源性，因而它们有着相似的作用机制。本实验室已获得小麦Mlo基因cDNA片段（长1434bp），所以可以通过RNAi技术或者反义技术关闭或者减弱植物本身Mlo基因的表达，赋予植物抗病性。 RNAi是一种抑制基因表达的技术手段，所具有的特异性、稳定性、高效、快速等特性为研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段，在应用研究中也发挥着越来越重要的作用。本研究分别在小麦Mlo基因cDNA片段（1434bp）编码区的5’和3’（对应于小麦MLO蛋白的N端和C端）选择抑制效率较高的部分，构建了植物RNAi表达载体pRI-Nmlo和pRI-Cmlo，并转化了小麦优质品种烟优361。 我们还对小麦Mlo基因cDNA片段的反义表达载体pRAL-anti-mlo转基因T0、T1、T2代植株进行了分子检测。从生物安全性的角度考虑，我们所使用的植物表达载体不含选择标记基因，所以不能通过抗生素或者除草剂进行筛选，而只能运用分子检测和表型鉴定来选择转基因阳性植株。由于我们使用小麦Mlo基因cDNA片段，理论上应该可以与植株内源的含内含子的基因组序列相互区分，但是小麦是异源六倍体，基因组情况比较复杂，推测可能含有多个Mlo同源基因，构成一个基因家族，这种基因组背景的复杂性为转基因的检测带来不少的困难，经过摸索，采用巢式PCR的方法进行检测。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
符号说明  8-9
第一部分 综述：植物抗病分子生物学及抗病基因工程  9-28
  1.抗病植物和病原物的相互识别  9-17
    1.1 R蛋白的结构特点  10-14
    1.2 无毒基因的特性  14-17
  2.植物抗病信号传导途径  17-24
    2.1 SA介导的抗病信号传导途径  17-21
    2.2 JA和Et介导的抗病信号传导途径  21-22
    2.3 诱导性的系统抗性  22-23
    2.4 信号通路间的相互作用  23-24
  3.植物的防卫反应基因研究进展  24-25
  4.植物抗病基因工程  25-28
第二部分 研究工作  28-62
  材料与方法  30-50
    1.实验材料  30-32
    2.常规方法  32-41
    3.实验方法  41-50
      3.1 小麦Mlo基因RNAi表达载体的构建  41-48
        3.1.1 小麦Mlo基因RNAi表达载体pRI-Nmlo的构建  43-47
        3.1.2 小麦Mlo基因RNAi表达载体pRI-Cmlo的构建  47
        3.1.3 RNAi表达载体转化农杆菌AGL1及对植物的遗传转化  47-48
      3.2 小麦Mlo基因反义表达植株后代的分子检测  48-50
        3.2.1 pRAL-antimlo转基因植株T_0代、T_1代和T_2代的PCR检测  48-49
        3.2.2 pRAL-antimlo转基因植株T_0代的PCR-Southern分析  49-50
        3.2.3 pRAL-antimlo转基因植株的表型观察  50
  结果与分析  50-58
    1.小麦Mlo基因RNAi表达载体的构建  50-53
      1.1 pRI-Nmlo的构建和鉴定  50-52
      1.2 pRI-Cmlo的构建和鉴定  52
      1.3 pRI-Nmlo和pRI-Cmlo表达载体转化小麦  52-53
    2.小麦Mlo基因反义表达植株后代的分子检测  53-58
      2.1 T_0代、T_1代和T_2的PCR检测  53-54
      2.2 T_0代的PCR-Southern分析  54-55
      2.3 pRAL-antimlo转基因植株的表型观察  55-58
  讨论  58-62
    1.关于各种抑制基因功能的方法的比较  58
    2.关于小麦的苗端转化  58-60
    3.关于转基因植株后代的分子检测  60
    4.关于转基因植株的表型变异  60-62
参考文献  62-66
致谢  66-67
发表文献  67-68
学位论文评阅及答辩情况轰  68

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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