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MLO-Y4中Cbfal诱导表达新基因的分离

作　者: 李丹
导　师: 姜华；刘文广
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 成骨细胞,骨细胞,抑制性消减杂交 (SSH)MLO-Y4 Cbfal Osx
分类号: R34
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 69次
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内容摘要

骨骼的形成和发育是与许多因素相关的复杂过程，转录因子是影响骨生长非常重要的因素。目前已知与成骨细胞分化相关的转录因子有两个：Cbfa1(Core Binding Factor 1)和Osx(Osterix)。Cbfa1于1997年被证明是控制骨形成的关键因子，适量表达可以促进成骨细胞的早期分化；而过量表达会抑制成骨细胞的成熟。2002年Kazuhisa等用抑制性消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)的方法分离出转录因子Osx。Cbfa1和Osx基因分别作用于成骨细胞分化的不同时期：Cbfa1调控间充质细胞向前成骨细胞分化，Osx在前成骨细胞向成骨细胞分化过程中起作用。本论文直接目的是分离可被Cbfa1诱导的新基因，长远目标在于找到与骨骼细胞分化相关转录因子。本文以具有早期骨细胞特征MLO-Y4(Murine Long Bone Osteocyte-Y4)细胞为研究对象，将Cbfa1基因转染到细胞内后，用抑制性消减杂交(SSH)方法进行新基因分离，成功构建了Cbfa1诱导下表达基因片段文库。从文库中随机选出的83个阳性克隆中，含有Cbfa1基因片段克隆24个，含有其它已知基因片段克隆19个，含有未知基因片段克隆40个，占克隆总数的67.8％。实验用Virtual Northern blot方法证明了其中一个没有同源序列的未知基因是Cbfa1诱导下表达的新基因。因为，在Cbfa1诱导的已知基因中有Osx存在，所以，MLO一Y4中Cbfal诱导表达新基因的分离实验进一步以RT一PCR法证实在MLO一Y4细胞中Cbfal可以诱导osx表达。本实验同时用RT一PCR法在另两种成骨细胞MC3T3一El、UZOS中也检测到了Cbfal诱导osx的表达。

全文目录

中文摘要  4-6
前言  6-19
  一文献综述  6-17
    (一) 骨骼的发育及其影响因素  6-7
    (二) 成骨细胞分化相关转录因子的研究及进展  7-12
      1 Cbfa1的发现以及研究进展  8-10
      2 Osx的发现以及研究进展  10-12
    (三) MLO-Y4细胞简介  12
    (四) 分离特异表达基因的方法研究以及进展  12-17
  二本论文的研究目的和意义  17-19
材料和方法  19-35
  一实验材料  19-20
    1 细胞及其培养试剂  19
    2 细胞转染以及RNA制备试剂  19
    3 SSH相关试剂以及药品  19
    4 主要仪器及设备  19-20
  二实验方法  20-35
    1 MLO-Y4细胞的培养  20-21
    2 大肠杆菌感受态细胞的制备  21
    3 感受态细菌的转化及α互补筛选  21
    4 转染质粒的制备  21-23
    5 MLO-Y4细胞的转染  23-24
    6 RNA的制备及电泳检测  24-25
    7 RT-PCR  25-26
    8 PCR-Selected subtraction(抑制性消减杂交SSH)  26-31
    9 Virtual Northern blot  31-35
结果与分析  35-46
  一检测转染效率的RT-PCR结果  35
  二抑制性消减杂交(SSH)的结果  35-46
    1 PCR法合成dsDNA  35-36
    2 回收产物经过RsaⅠ酶切后电泳结果  36-37
    3 两次PCR的结果  37
    4 检测探针制备及Virtual Northern blot结果  37-38
    5 构建消减文库以及测序结果  38-43
    6 进一步筛选的结果  43-44
    7 在MLO-Y4和另两种成骨细胞中Cbfa1对Osx作用  44-46
讨论  46-50
  一 MLO-Y4细胞的转染  46
  二 SSH成功的必要条件  46-48
  三测序结果分析  48
  四 Cbfa1在两种成骨细胞中诱导Osx的表达  48-50
结论  50-51
英文摘要  51-53
参考文献  53-57
致谢  57-58
独创性声明  58

MLO-Y4中Cbfal诱导表达新基因的分离

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