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阴沟肠杆菌产AmpC酶的表型及相关基因ampC和ampD的初步研究

作　者: 赵越
导　师: 葛庚芝
学　校: 天津医科大学
专　业: 内科学
关键词: 阴沟肠杆菌 AmpC酶多底物协同-拮抗法 ampc基因 ampD基因突变
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

阴沟肠杆菌(Enterobacter Cloacae, ECL)是一种常见的革兰阴性条件致病菌,常引起呼吸道、泌尿生殖道以及伤口等的感染。近二十年来,随着第三代、第四代头孢菌素和免疫抑制剂等的使用及各种侵入性操作在临床的广泛应用,多重耐药革兰阴性杆菌引起的感染备受关注,其中以阴沟肠杆菌、产气肠杆菌为主的肠杆菌属细菌已成为医院感染中重要的致病菌。大量研究表明,高产AmpCβ-内酰胺酶(AmpC酶)是阴沟肠杆菌对青霉素类、第一至三代头孢菌素、头霉素类和单环类耐药的主要机制。快速、准确地检测出高产AmpC酶的菌株,有利于指导临床医生合理使用抗菌药物和院内感染控制的管理。目的：1.使用多底物协同-拮抗法(multi-substrates synergy-antagonize test, MSSAT)检测阴沟肠杆菌产AmpC酶的表型。2.对阴沟肠杆菌ampC基因、ampD基因的携带情况以及AmpD的氨基酸替代位点与AmpC酶表型的关系进行初步研究。方法：1.收集天津医科大学第二医院呼吸科微生物实验室2006年1月至2009年6月期间临床分离的阴沟肠杆菌,全部经生化反应重新鉴定；使用多底物协同-拮抗法(MSSAT)检测阴沟肠杆菌产AmpC酶的表型。2.通过聚合酶链反应(PCR)扩增结构基因ampC和调节基因ampD的基因片段。不同表型的阴沟肠杆菌ampD基因的PCR扩增产物送DNA测序,结果与Kopp U报道的阴沟肠杆菌14的ampD基因序列(GenBank登录号Z14003.1)进行比对,分析ampD基因突变与AmpC酶表型的关系。结果：1.2006年1月至2009年6月,从天津医科大学第二医院呼吸科微生物实验室收集的标本中分离出阴沟肠杆菌31株。来源于呼吸科病房18株,呼吸科门诊7株,ICU病房6株。采用MSSAT方法检测显示阴沟肠杆菌不产AmpC酶2株(2/31,6.5%,痰标本1株,尿标本1株),产高诱导型AmpC酶15株(15/31,48.4%,痰标本12株,尿标本2株,咽拭子标本1株),产部分去阻遏型AmpC酶9株(9/31,29.0%,均为痰标本),产完全去阻遏型AmpC酶5株(5/31,16.1%,痰标本4株,尿标本1株)。2.31株阴沟肠杆菌的结构基因ampC和调节基因ampD经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳均检测到相应目的片段的条带。3株不同表型阴沟肠杆菌ampD基因片段均存在多处位点变异,对应氨基酸的替代位点分别为高诱导型Asp-59→Asn,Ala-71→Arg,Leu-72→Val,Asp-75→His,Gln-103→His,Thr-122→Ser,Glu-131→Gln,Lys-132→Gln,Val-136→Ile,Gln-138→His,Arg-143→Leu,Glu-160→Ala,His-175→Arg,Thr-179→Ala,Thr-180→Ala,Thr-187→Asn:部分去阻遏型Ala-71→Arg,Leu-72→Val,Asp-75→His,Gln-103→His,Ala-128→Ser,Glu-131→Gln,Lys-132→Gln,Val-134→Ala,Gln-138→Arg,Arg-143→Leu,Glu-160→Ala,Ser-172→Pro,His-175→Arg,Thr-180→Ala;完全去阻遏型Ala-71→Arg,Leu-72→Val,Asp-75→His,Ala-158→Val,Ile-186→Thr。结论：1.本研究选用阴沟肠杆菌31株,主要来源为呼吸科病房,主要标本为痰标本。本研究采用多底物协同-拮抗法鉴定出阴沟肠杆菌产AmpC酶表型以高诱导型为主,其次为部分去阻遏型,完全去阻遏型检出率相对较低。2.本研究中PCR方法扩增阴沟肠杆菌ampC和ampD基因均获得相应大小的目的片段。AmpD蛋白的128、134、138、172位发生氨基酸替代可能导致AmpC酶的部分去阻遏高表达。158、186位可能是AmpD蛋白的关键位点,其发生氨基酸替代可能导致AmpC酶的完全去阻遏高表达。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语/符号说明  10-12
前言  12-14
  研究现状、成果  12-13
  研究目的、方法  13-14
一、阴沟肠杆菌产AmpC酶的表型检测  14-34
  1.1 对象和方法  14-21
  1.2 结果  21-30
  1.3 讨论  30-33
  1.4 小结  33-34
二、阴沟肠杆菌产AmpC酶相关基因的检测  34-44
  2.1 对象和方法  34-38
  2.2 结果  38-41
  2.3 讨论  41-43
  2.4 小结  43-44
结论  44-45
参考文献  45-50
发表论文和参加科研情况说明  50-51
附录  51-57
综述  57-77
  综述参考文献  71-77
致谢  77

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