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用PCR法快速定量人类粪便中双歧杆菌的研究

作　者: 于静
导　师: 唐立
学　校: 大连医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 定量双歧杆菌普通PCR real-time PCR 粪便
分类号: R446.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

目的:人类肠道拥有大量活跃、复杂的菌群,其中约占正常成人肠道菌群3%,婴儿肠道菌群75%-91%的双歧杆菌是一种重要的维持肠道微生态平衡的生理菌,具有预防腹泻与肠道感染、缓解便秘、免疫调节的作用,[1,2]快速准确定量人类粪便中的双歧杆菌对于分析肠道复杂菌群的结构,配合临床检验指导临床用药,保持肠道菌群动态平衡,维持健康预防疾病具有重要意义。目前国内外对于肠道中双歧杆菌的定量采用的对粪便标本进行稀释滴种法分离计数,费时费力;在提取DNA基础上建立的普通PCR法只能定性和半定量,[3]DNA提取步骤繁琐且DNA提取中用到的酚、蛋白酶K等试剂易抑制PCR扩增,[4]影响双歧杆菌的定量。本实验的目的是将粪便离心、洗涤处理后,不经过分离培养和DNA提取纯化步骤,用real-time PCR 建立快速、准确从粪便标本中定量双歧杆菌。方法:实验分为二部分:第一部分用普通PCR法定量人类粪便中双歧杆菌。根据16SrRNA基因设计双歧杆菌属特异引物,将粪便离心、洗涤处理后,不经过分离培养和DNA提取纯化步骤,用普通PCR法从粪便标本中半定量双歧杆菌。并且比较普通PCR定量的双歧杆菌结果和传统稀释滴种法定量的双歧杆菌结果的相关性。第二部分用real-time PCR法定量人类粪便中双歧杆菌。利用相同的双歧杆菌属特异引物,将粪便离心、洗涤处理后,不经过分离培养和DNA提取纯化步骤,但经过系列稀释粪便后用real-time PCR定量双歧杆菌。并且比较 real-time PCR定量的双歧杆菌结果和传统稀释滴种法定量的双歧<WP=5>杆菌结果及普通PCR定量的双歧杆菌结果的相关性。实验采用健康成人粪便标本20例,便秘及腹泻粪便标本10例。结果:1、粪便标本前处理采取简单的离心和清洗、稀释步骤去除粪便标本中的抑制物,加入2%TritonX-100释放DNA模板。2、粪便标本普通PCR得理论菌数与培养得菌数值之间无显著差异(P>0.05);粪便标本普通PCR得灰度值与培养得菌数值之间明显相关(P<0.05)。3、粪便标本real-time PCR得理论菌数与培养得菌数值之间无显著差异(P>0.05);粪便标本real-time PCR得理论菌数与普通PCR得灰度值之间明显相关(P<0.05)。结论:应用普通PCR能快速半定量人类粪便中双歧杆菌,real-time PCR能准确、快速定量人类粪便中双歧杆菌。

用PCR法快速定量人类粪便中双歧杆菌的研究

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