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太平洋牡蛎四倍体育种研究

作　者: 李慷均
导　师: 王昭萍
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 太平洋牡蛎Crassostrea gigas 四倍体育种二倍体三倍体细胞学观察
分类号: S968.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本文对贝类四倍体育种研究进展进行了综述，论述了贝类四倍体育种的研究现状与意义，探讨了人工诱导贝类四倍体的方法和基本原理、诱导结果、诱导剂的作用机理、影响因素、倍性检测方法和四倍体贝类的生物学特性以及四倍体育种中存在的非整倍体现象，分析了贝类四倍体育种存在的问题并展望了其育种前景。本研究以太平洋牡蛎为研究对象，采用CB、6-DMAP做诱导剂，通过从二倍体直接诱导四倍体和利用三倍体诱导四倍体两种途径诱导牡蛎四倍体，并对诱导的细胞学过程进行了荧光观察和描述。通过三倍体产生的卵子与二倍体受精抑制一个极体的方法，培育出了存活的四倍体幼贝。 1、通过二倍体诱导四倍体利用二倍体太平洋牡蛎的精卵授精，在第一极体释放前，采用CB(0.75mg／L)、6-DMAP(70mg／L)分别处理受精卵15min抑制第一极体(Pb1)，或者处理30min同时抑制两个极体释放(Pb1+Pb2)，诱导产生四倍体。胚胎期的染色体计数结果表明：通过CB抑制Pb1以及通过6-DMAP抑制Pb1和Pb2两种处理手段诱导效果较好，前者胚胎四倍体率平均为18.41％，比通过CB抑制Pb1和Pb2平均高26.62％；后者胚胎四倍体率平均为17.90％，是6-DMAP抑制Pb1的2.17倍。另外，实验还发现通过CB诱导四倍体比通过6-DMAP诱导的效果要好，因为不论抑制Pb1还是同时抑制Pb1和Pb2，CB处理组的四倍体率均较高，而通过6-DMAP抑制Pb1的四倍体率极低。 2、通过三倍体诱导四倍体本研究对太平洋牡蛎三倍体逐个解剖，选用卵子质量较好的个体，分别与二倍体精子授精(即单对受精)，分别采用CB(0.75mg／L)和6-DMAP(70mg／L)处理受精卵，抑制其Pb1或Pb2的释放获得四倍体。D型幼虫期的流式细胞仪检测结果表明，17个处理组的幼虫四倍体率为38.30％-75.59％，平均52.31％。其中，太’}元洋生L蜗(Cr口5505御口glgQs)四倍体育种研究利用CB抑制Pbl或PbZ的幼虫四倍体率分别平均为58.72%(40.16%一75.59%)和4一03%(38.30%一45.16%)，利用6一DMAP抑制Pb一或PbZ的幼虫四倍体率分别平均为51.97%(38.57%一62.18%)和58.71%(50.45%一68.87%)。结果表明CB对于抑制Pbl的效果好于6一DMAP，而6一DMAP抑制PbZ的效果好于CB。3、四倍体的培育三倍体太平洋牡蜘卵子的受精率波动范围较大(14.6%一99.1%)，平均71.14%;受精卵的孵化率平均为8.99%，共孵化出D型幼虫162.22万粒;幼虫的存活率很低，四天后的幼虫存活率仅40.48%，至D22(开始出现眼点)时，存活率为0一3.33%，平均2.40%;共获稚贝2335粒，从孵化至变态为稚贝的存活率仅为0.0049%。稚贝在室内培育至9月底后，下海进行吊笼养殖。8月龄时，平均壳长2.58士0.93cm。取6一DMAP和CB处理组共106个幼贝进行活体倍性检测，四倍体率分别为91.01%和70.59%，共获得了93个存活的四倍体太平洋牡蝠。四倍体牡蜗的平均壳长2.47士0.80em(n二93)，三倍体3.55士0.38(n=11)，与三倍体相比，四倍体未表现出生长优势。4、四倍体诱导过程中核变化的荧光观察本研究采用DAPI染色荧光显微方法，连续观察了CB、6一DMAP抑制太平洋牡蝠(Crassostrea glga，)二倍体或三倍体的受精卵极体释放(诱导方法同上)的细胞学过程。采用CB、6一DMAP分别抑制二倍体受精卵第一极体的释放，均使受精卵第二次减数分裂中染色体的分离行为发生变化，出现了二极分离、三极分离以及极少的四极分离形式;采用CB抑制太平洋牡蜗三倍体的受精卵第一极体的释放，随后的第二次减数分裂产生二极分离、三极分离和四极分离现象，均证实了第一次减数分裂的抑制能导致第二次减数分裂的复杂化。对6一DMAP抑制三倍体受精卵第二极体的释放的观察表明，受精卵按常规的二极分离方式进行减数分裂，但第二次分裂中应作为PBZ排出的那组染色体保留下来，与精核结合后形成四倍体。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
前言  9-10
第一章文献综述--贝类四倍体育种研究进展  10-26
  1 、贝类四倍体育种研究的现状  10-14
  2 、四倍体育种的方法和基本原理  14-19
  3 、常用诱导方法及其作用机理  19-20
  4 、四倍体诱导的影响因素  20-21
  5 、四倍体育种中的非整倍体现象  21-22
  6 、四倍体贝类的生物学特性  22-23
  7 、倍性检测  23-24
  8 、贝类四倍体育种前景及展望  24-26
第二章太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)四倍体的诱导  26-42
  第一节利用太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)二倍体的卵诱导四倍体  27-33
    1 、材料与方法  27-28
      1.1 材料  27
      1.2 方法  27-28
    2 、结果  28-30
    3 、讨论  30-33
      3.1 四倍体的诱导  30-32
      3.2 影响四倍体诱导的因素  32-33
  第二节利用太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)三倍体的卵诱导四倍体  33-42
    1 、材料与方法  33-35
      1.1 材料  33
      1.2 方法  33-35
    2 、结果  35-37
      2.1 四倍体太平洋牡蛎的诱导结果  35-37
      2.2 受精卵第一极体的观察  37
    3 、讨论  37-42
      3.1 诱导率  37-40
      3.2 CB和6-DMAP的诱导效果  40-41
      3.3 影响因素  41-42
第三章太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)四倍体的培育  42-52
  1 、材料与方法  42-43
    1.1 材料  42
    1.2 方法  42-43
  2 、结果  43-48
    2.1 受精卵与24h孵化幼虫的关系  43-44
    2.2 四倍体幼虫的生长  44-45
    2.3 四倍体群幼虫的存活  45-46
    2.4 幼贝的倍性检测及分离  46
    2.5 四倍体贝的生长  46-48
  3 、讨论  48-52
    3.1 幼虫的生长  48-49
    3.2 四倍体幼虫的存活力  49-50
    3.3 四倍体诱导组的倍率变化  50-51
    3.4 四倍体的生长  51-52
第四章荧光观察  52-69
  第一节 CB、6-DMAP抑制太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)二倍体的受精卵极体释放的荧光显微观察  52-59
    1 、材料与方法  53-54
      1.1 材料  53
      1.2 方法  53-54
    2 、结果  54-56
      图版Ⅰ、二倍体受精卵加药处理后的染色体分离  55-56
      图版Ⅱ、二倍体受精卵加药处理后的染色体分离  56
    3 、讨论  56-59
  第二节 CB、6-DMAP抑制太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)三倍体的受精卵极体释放的荧光显微观察  59-69
    1 、材料与方法  59-61
      1.1 材料  59-60
      1.2 方法  60-61
    2 、结果  61-62
      2.1 对照组受精卵的染色体分离  61
      2.2 通过CB抑制三倍体受精卵Pb1释放的染色体分离  61-62
      2.3 通过6-DMAP抑制三倍体受精卵Pb2释放的的染色体分离  62
    3 、讨论  62-69
      3.1 正常三倍体卵的染色体分离  62-63
      3.2 抑制受精卵第一极体的染色体分离  63-65
      3.3 抑制受精卵第二极体的染色体分离  65-66
      图版Ⅲ、三倍体受精卵的正常染色体分离  66-67
      图版Ⅳ、 CB抑制三倍体受精卵Pb1释放后的染色体分离  67-68
      图版Ⅴ、 6-DMAP抑制三倍体受精卵Pb2释放后的染色体分离  68-69
参考文献  69-76
致谢  76

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