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背景随着糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)发病人数的日益增多,糖尿病的相关并发症也成为目前糖尿病研究关注的焦点。糖尿病性胃肠病是糖尿病极为常见的慢性并发症之一,发病率高达76%。糖尿病胃肠病不仅严重影响患者生活质量,而且妨碍降糖药物吸收,干扰治疗。其中,糖尿病结肠动力障碍是最常见的症状之一。目前糖尿病及其相关并发症的治疗方案主要是药物治疗以及胰岛素注射,其高昂的费用支出给患者和社会带来沉重负担,效果差强人意。近年来,移植胰岛治疗糖尿病已初见成效,但该方法仍面临两大难题,即组织来源不足以及免疫排斥反应。干细胞研究是目前的热点,骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)取材方便,容易进行体外分离、培养和纯化,具有跨越分化潜能,免疫原性低的特点,国内外已有大量关于BMMSC_s诱导分化为胰岛细胞的研究,若能进行BMMSC_s的定向诱导分化并实现在体移植治疗,可使干细胞治疗的临床应用更进一步。胃肠功能紊乱性疾病常常和胃肠起搏细胞Cajal间质细胞(Interstitial Cells of Cajal, ICCs)结构形态的变化有关。ICC_s可产生慢波电位起搏胃肠活动及传导电兴奋,并且作为神经递质与平滑肌之间的中介,综合调控胃肠道运动。ICC_s表面存在多种受体,其中c-Kit是一种酪氨酸激酶受体,可与干细胞因子(Stem Cell Factor, SCF)结合,维持ICC_s的必要功能。有研究表明,DM小鼠发生胃肠活动紊乱时ICC_s形态、数量和功能均受到不同程度的影响,ICC_s的异常改变可能是DM结肠动力障碍的重要原因之一。干细胞能否分化为包括ICC_s在内的功能细胞,或起到类似的作用,是目前干细胞治疗研究的热点。目的1,离体培养小鼠骨髓间充质干细胞,移植至糖尿病结肠动力障碍小鼠模型中,观察其对结肠动力障碍的改善作用;2,初步探讨异体骨髓间充质干细胞在体存活分化的机制,及其如何改善糖尿病小鼠结肠动力障碍。方法实验动物选用体重18-22g的雄性C57BL/6小鼠,禁食4小时,腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)50mg/kg制备Ⅰ型糖尿病模型,每天1次,连续5天。4周后连续监测静脉血糖5天,血糖均高于16.7mmol/L视为成模。成模12周后给予印度墨水10mL/kg灌胃,记录排出时间,排出时间与对照组具备显著性差异时,则确认小鼠糖尿病结肠动力障碍模型建立成功。原代培养扩增β-gal转基因小鼠的骨髓间充质干细胞,取第3代BMMSCs通过尾静脉注射(0.5×10~6/只)移植至部分成模的糖尿病结肠动力障碍小鼠及空白对照组小鼠中,其余成模小鼠及空白组小鼠尾静脉注射等量的生理盐水。移植两周后进行相关检测。1,离体结肠自发收缩功能记录。各组小鼠脱臼处死,取1cm近端结肠在离体器官培养装置中连接张力换能器,利用Powerlab生物信号采集系统记录其肌张力指标。2,离体结肠平滑肌单细胞细胞内慢波电位自发放记录。近段结肠沿肠系膜剪开制备肌条,取2×3mm大小,去除粘膜层,固定于灌流槽中,以玻璃微电极连接放大器,利用Powerlab生物信号采集系统记录细胞内慢波电位活动,记录肠平滑肌细胞静息膜电位,自发放电幅度及频率。3,免疫印迹法(Western blot)检测近段结肠干细胞因子SCF及结肠起搏细胞ICCs标记蛋白c-Kit在蛋白水平的表达。4,反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)检测SCF及c-Kit在mRNA水平上的表达。5,组织化学检测。Tunnel法检测近段结肠细胞凋亡情况;c-Kit免疫荧光染色检测ICCs数量变化;α-Smooth Muscle Actin染色检测平滑肌细胞变化; c-kit&Ki67免疫荧光双标染色检测ICCs的增殖能力变化及不同类型ICCs变化;c-Kit与β-gal免疫荧光双标染色检测移植的BMMSCs在近段结肠定位。结果1,BMMSCs移植组小鼠结肠自发收缩幅度及频率均显著高于DM组小鼠,接近空白对照组小鼠水平;在离体平滑肌细胞的慢波电位记录中也得到了相似的结果。2,BMMSCs移植组小鼠的c-Kit及SCF的蛋白与mRNA水平的表达均显著高于DM组小鼠,其中SCF的表达与空白组小鼠无明显差异。3,BMMSCs移植的小鼠近段结肠凋亡细胞相对DM组减少,促使ICCs包括平滑肌细胞增殖。并且β-gal标记的BMMSCs在近段结肠有多处阳性表达。结论1,BMMSCs移植改善了DM晚期小鼠结肠动力障碍症状,促使慢波启动,一定程度恢复肌张力;2,其原因可能是干细胞直接促进SCF释放,维持ICCs的SCF-KIT通路,从而修复DM结肠动力障碍时的ICCs网络损伤;3,并且同时减少了包括ICCs在内的近段结肠的细胞凋亡,促使ICCs的增殖,直接完善ICCs网络的起动慢波功能;4,推断结论:MSCs归巣至损伤消化道的过程中,SCF-Kit通路的反馈调节能够使MSCs自身的c-kit受体活化,促使其向平滑肌细胞分化,甚至表达kit阳性,分化为ICC,直接起动慢波产生。
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