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水稻黄单胞菌烯酰-ACP还原酶（FabV）晶体学研究

作　者: 张晓莉
导　师: 何进
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 水稻黄单胞菌烯酞-ACP还原酶Ⅵ FabV 蛋白质结晶 X-Ray衍射晶体学
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

脂肪酸生物合成途径分为两种类型,即FASⅠ与FASⅡ。其中,FASⅠ中的一系列酶活性位点位于一个巨大的多功能复合体的不同结构域上,如哺乳动物；FASⅡ中的每一种酶活性位点均处于不同的蛋白质上,每一个反应都是由一个单独的酶催化,广泛存在于植物、细菌和其他生物中。烯酰-ACP还原酶(enoyl-ACP reductase, ENR)是催化细菌FASⅡ从头合成途径中最后一步还原反应的关键酶。如果烯酰-ACP还原酶被抑制,细菌的生长和繁殖将会受到阻断。所以,烯酰-ACP还原酶是一种开发新型抗菌剂的非常有用的靶标。烯酰-ACP还原酶有四种同工酶,即FabI、FabK、FabL、FabV,分布于不同种属的细菌中。其中,FabV是最近从霍乱弧菌(Vibrio cholera)中发现的,从一级结构上看,它比短链脱氢/还原酶超家族(short-chain dehydrogenase/reductase, SDR)的普通成员序列要长60%,且与ENRs家族的其它成员序列一致性很低。其保守催化基序中酪氨酸与赖氨酸的序列间隔为8个氨基酸(Tyr-X8-Lys),比ENRs家族家族中的其他成员多1-2个,这可能是FabV对广谱抑菌剂—三氯生(triclosan)具有抗性的主要原因。由此,FabV有望成为筛选潜在选择性抑制剂的新靶标。水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害,是由水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)引起的,而X. oryzae仅存在新发现的的FabV(XoFabV)。由于FabV的同源结构目前还不存在,这就为以其为靶标的抑制剂筛选和其催化机制的研究带来困难。所以通过晶体学方法首次获得XoFabV的三维空间结构,对于揭示FabV的结构和催化机制将是非常有意义的。本课题通过克隆、表达、纯化XoFabV的蛋白,借助分子排阻色谱分析发现其在溶液中主要以两种聚体形式存在,根据分析超速离心的结果确定这两种聚体形式分别为单体和二聚体,单体的分子量约为51 kDa。通过圆二色谱法研究其单体和二聚体形式的二级结构的异同,发现两者二级结构中都富含α-螺旋和β-折叠,且二者含量无差异。利用悬滴式气液扩散法和美国Hampton Research公司的晶体筛选试剂盒进行初筛,得到了XoFabV的结晶条件并进行优化,得到其最佳结晶条件为15%PEG3350,0.1 M Bis-Tris pH 5.5,125 mM NaCl,蛋白质浓度为10mg/mL,最适生长温度为16℃。然后将在上述相同的条件中培养获得的高质量的硒代XoFabV晶体,通过日本Spring-8同步辐射仪BL41XU光源收集多波长异常衍射的数据,分辨率可达1.67A。其中,仪器分析参数为-73℃,光源波长分别为Peak:0.9798 A：Edge:0.9801 A：Remote:0.9000 A。然后对所得的晶体数据利用PHENIX软件包进行分析,显示XoFabV属于P212121空间群,晶胞参数为a=49.250,b=73.350,c=106.550,α=β=γ=90°,溶剂含量为43.23%。根据氨基酸序列比对结果分析发现,与普通SDR家族的保守基序YX3-7K不同,XoFabV与纤细眼虫(Euglena gracilis)中的烯酰-CoA还原酶(TER)的氨基酸序列相似性较高。XoFabV保守催化基序为YX8K,位于236-245位,其在N-末端48-54位含有中链脱氢还原酶超家族(middle-chain dehydrogenase/reductase, MDR)超家族的NADH典型结合位点GX1-3GX1-3G,即富含Gly的GASSGYG基序。在C-末端377-386位含有FAD结合位点FGFXXXXXDY,即FGFGRIDVDY。XoFabV结构除了具有与大肠杆菌的烯酰-ACP还原酶(EcFabI)相似的Rossman折叠外,其序列上的冗余部分还形成了一个巨型帽子结构(其下存在催化位点)和FAD的结合区(位于口袋的外侧)。XoFabV结构中的Rossman折叠由7个侧翼α-螺旋(α2-α8)和7个β-折叠(β1-β4、β9-β11)所形成的p-折叠片层组成。其中,α2、α3、α8位于β-折叠片层的一侧,而α4、α5、α6则位于另一侧,长螺旋α5于G198、G199处形成一个“扭结”导致螺旋的中断。NADH的结合位点可能会位于β-片层支架上,而底物结合位点应该位于NADH的结合位点上方。同时,FAD结合位点位于口袋外侧,以α1,α10为支架,推测FAD结合后的主要作用是稳定XoFabV的构象。XoFabV晶体结构的获得,不仅能提供FabV的第一手空间结构数据,而且能为以FabV为靶标的全新高效选择性抑制剂的设计与筛选和FabV的催化机制研究提供理论依据。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
缩略语表  11-12
1 前言  12-23
  1.1 水稻黄单胞菌及其危害  12
  1.2 新型抗菌物质的生物合理设计与作用靶标的选择  12-13
  1.3 脂肪酸合成途径简介  13-16
  1.4 烯酞-ACP还原酶的结构差异  16-17
  1.5 水稻黄单胞菌中的烯酞-ACP还原酶  17-19
  1.6 以细菌FASⅡ途径为靶标的抗菌物质研究现状  19
  1.7 蛋白质晶体学原理  19-22
    1.7.1 蛋白质结晶的方法  20
    1.7.2 蛋白质结晶条件的筛选和优化  20-21
    1.7.3 晶体结构解析方法  21-22
  1.8 研究目的与意义  22-23
2 材料和方法  23-31
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 细菌菌株与质粒  23
    2.1.2 主要试剂与耗材  23
    2.1.3 主要溶液的配制  23-25
    2.1.4 主要仪器  25
  2.2 方法  25-31
    2.2.1 Xoo fabV基因的克隆  25-27
      2.2.1.1 小量制备质粒DNA  25
      2.2.1.2 菌落PCR扩增Xoo fabV基因  25-26
      2.2.1.3 E.coli BL21(DE3)感受态的制备  26
      2.2.1.4 pET28b(+)/fabV载体构建  26
      2.2.1.5 重组质粒的转化  26
      2.2.1.6 阳性克隆子的验证  26-27
      2.2.1.7 重组质粒表达的小量检测  27
    2.2.2 重组XoFabV的表达及纯化  27-29
      2.2.2.1 重组蛋白XoFabV的可溶性检测  27
      2.2.2.2 Ni~(2+)-NTA亲和纯化  27-28
      2.2.2.3 蛋白质浓缩  28
      2.2.2.4 分子排阻色谱纯化  28
      2.2.2.5 A_(280)/A_(260)法测定蛋白溶液的浓度  28-29
    2.2.3 重组XoFabV蛋白的体外酶活性检测  29
    2.2.4 圆二色谱分析法分析重组XoFabV蛋白的二级结构  29
    2.2.5 重组XoFabV蛋白的超速离心分析  29-30
    2.2.6 重组XoFabV蛋白质晶体的培养  30-31
      2.2.6.1 晶体生长的准备  30
      2.2.6.2 悬滴法培养晶体  30
      2.2.6.3 硒代XoFabV蛋白质样品的准备  30-31
      2.2.6.4 浸泡重原子法制备同晶置换晶体  31
    2.2.7 重组XoFabV蛋白质晶体的结构解析及结构模型  31
3 结果与分析  31-46
  3.1 Xoo fabV基因的克隆  31
  3.2 重组XoFabV蛋白的表达及纯化  31-34
  3.3 重组XoFabV蛋白的体外酶活性检测  34-35
  3.4 XoFabV超速离心的分析结果  35-36
  3.5 XoFabV二级结构分析  36-37
  3.6 重组XoFabV蛋白质晶体的培养  37-39
  3.7 硒代XoFabV蛋白的纯化  39-40
  3.8 硒代XoFabV蛋白质结构的解析  40-43
  3.9 XoFabV/NAD+复合体晶体的生长  43-46
4 讨论  46-52
5 总结与展望  52-54
参考文献  54-61
致谢  61

水稻黄单胞菌烯酰-ACP还原酶（FabV）晶体学研究

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