学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

Caco-2细胞模型的建立及在口服药物吸收中的应用

作　者: 左克源
导　师: 裘军
学　校: 华中科技大学
专　业: 药理学
关键词: Caco-2细胞更昔洛韦跨膜转运 P-gp PVPk30
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 890次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

Caco - 2细胞来源于人结肠腺癌细胞,在培养条件下形成极性单细胞层,具有微绒毛以及紧密连接等类似于人体小肠上皮细胞刷状缘侧的分化特征。接种到碳酸聚酯多孔膜等基质上,可分化出肠腔侧（Apical ,AP侧）和肠内壁侧（Basolate ral ,BL侧）。AP侧含有典型的小肠微绒毛水解酶、CYP1A1、β-葡萄糖醛酸糖苷酶和包括P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的各种营养物质转运载体,可发挥主动转运物质作用,并且Caco - 2细胞保留了P - gp高表达特性,P-糖蛋白是一种170Kd大小的多药耐药基因（MDR1）调控的外排蛋白,主要功能是外排各种外来异物,保护机体不受外来异物的侵扰。其“药物溢出泵”（drug efflux pump）作用是导致药物低生物利用度的主要原因之一。研究发现正常组织细胞中如人体的胃肠道上皮细胞、肝实质细胞、肾、血脑屏障的内皮细胞P-糖蛋白广泛存在。目前, Caco - 2细胞模型被认为是研究口服药物在吸收过程中相互作用的有效模型。作为药物吸收研究的一种快速筛选工具,Caco-2细胞模型广泛用于研究药物的代谢、吸收机制[2-3]、及药物毒性等,此细胞具有与小肠上皮细胞相同的细胞极性和紧密连接,可以模拟小肠上皮细胞吸收特性[4]。本论文建立了体外培养的Caco-2细胞模型,并应用此模型对药物辅料进行体外筛选,寻找可能的P-gp抑制剂,在此基础上研究低生物利用度药物吸收的影响,为提高其生物利用度提供实验依据。1. Caco-2细胞模型的建立与评价1.1目的:建立Caco-2单层细胞模型用以模拟小肠上皮,并且应用此模型对促进低生物利用度药物更昔洛韦吸收的辅料进行筛选。评价Caco-2细胞的正常生长特性,以及可以在日常培养中对系统进行监控。1.2材料:实验所用Caco-2细胞来自武汉大学细胞培养中心。实验所用代数在40—60代之间。培养液为DMEM（4.5g/lD-glucose）,含1%非必需氨基酸,1%L-谷氨酰胺,100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素,10%胎牛血清（FBS）0.25%胰蛋白酶溶液,Millicell抵入式培养器（美国Millipore公司）。1.3方法:1.3.1细胞形态学观察:将细胞培养于培养瓶中,隔天换液,培养14天,用显微镜观察并做透射电镜观察细胞的超微结构。1.3.2 TEER值的测定:在进行药物的转运试验之前,用细胞电阻仪测定跨上皮细胞电阻（transepithelium electrical resistance,TEER）,确定细胞单层的完整性。1.3.3碱性磷酸酶活性的测定:本文采用ALP/AKP试剂盒考察Caco-2细胞单层的碱性磷酸酶的活性,评价Caco一2细胞的生长分化特征。1.3.4苯酚红通透性的测定:将苯酚红作为Caco一2细胞单层模型跨细胞被动转运的标记物【7】,在pH7.2～7.4的情况下进行苯酚红从细胞模型顶侧AP到基底侧BL的转运试验,计算苯酚红跨膜通量,确定细胞单层的完整性和紧密性。1.4结论:采用光镜,电镜,苯酚红通透量,跨膜电阻以及碱性磷酸酶活性评价Caco-2细胞生长特性及用于药物研究的可行性。结果表明本实验室的Caco-2单层细胞培养物在培养条件下具有微绒毛,苯酚红通透量<5%,跨膜电阻值>220?.cm2,碱性磷酸酶主要集中在绒毛膜面,与小肠类似,可以作为研究小肠药物转运的体外模型。2应用Caco-2细胞模型研究药用辅料PVPK30对更昔洛韦吸收的影响应用Caco-2细胞研究PVPK30的细胞毒性发现,浓度为30mg/ml以下的PVPK30未显示细胞毒性,由此确定30、3、0.3mg/ml为跨膜转运试验的高、中、低3种浓度。利用电阻仪测定电阻值和酚红透过实验检验其单层细胞的完整性。完整性检测合格后即可用P-gp已知的底物维拉帕米[1]为阳性对照,塞利洛尔作为探针药物,利用HPLC法测定药物跨膜转运量,结果表明PVPK30高浓度在Caco-2细胞模型中明显抑制P-gp药泵作用减少塞利洛尔从Caco-2单层细胞膜BL侧向AP侧的转运,促进AP侧向BL侧转运,提高塞利洛尔的跨膜转运,表明,PVPK30为有效的P-gp药泵抑制剂。在此基础之上,研究PVPK30对低生物利用度药物更昔洛韦吸收的促进作用。跨膜转运2小时后PVPK30+更昔洛韦各浓度组BL侧浓度分别为:1.7990,2.0023,2.0416 ug/ml均大于更昔洛韦单独跨膜转运2小时后BL侧浓度:1.4978 ug/ml ,而阳性对照组更昔洛韦+维拉帕米2小时后BL侧浓度为:1.7392 ug/ml,同时发现PVPK30促进药物转运具有一定浓度依赖性,SPSS软件分析ratio值(BL→AP侧Papp值与AP→BL侧P_app值比值)结果表明:维拉帕米阳性对照组与阴性对照组之间有显著性差异（P<0.05）, PVPK30低浓度组与阴性对照组有显著性差异（P<0.05）,PVPK30中浓度组和PVPK30高浓度组与阴性对照组之间均有显著性差异（P<0.05）。结论:研究发现药用辅料PVPK30可以抑制P-gp外排作用,并能作为P-gp抑制剂促进低生物利用度药物更昔洛韦吸收。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-11
前言  11-13
  1 Caco-2 细胞模型主要应用  11-12
  2 应用Caco-2 细胞模型研究P一糖蛋白与生物利用度之间的关系  12-13
第一部分 Caco－2 细胞模型的建立及其评价  13-30
  Ⅰ Caco-2 细胞生长曲线的制备(MTT 法)  13-17
  Ⅱ Millicell内 Caco-2 细胞 TEER 值变化观察  17-21
  Ⅲ Caco-2 细胞模型透射电镜  21-22
  Ⅳ 苯酚红通透性实验研究  22-26
  Ⅵ Caco-2 细胞碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase actirity, ALP)活性测定  26-29
  小结  29-30
第二部分应用Caco－2细胞模型研究药用辅料PVPK30对更昔洛韦吸收的影响  30-49
  Ⅰ PVPK30 对Caco－2 细胞的细胞毒性研究  30-31
  Ⅱ PVPK30 作为p－gp 药泵抑制剂的研究  31-41
  Ⅲ PVPK30 对更昔洛韦生物利用度的影响  41-48
  小结  48-49
讨论  49-51
参考文献  51-53
综述  53-65
致谢  65-66
附录  66

Caco-2细胞模型的建立及在口服药物吸收中的应用

内容摘要

全文目录

相似论文