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光滑球拟酵母中NADH代谢对其酵解途径的影响

作　者: 董志姚
导　师: 李秀芬
学　校: 江南大学
专　业: 生物化工
关键词: NADH 葡萄糖酸钠选择性NADH氧化酶 NADH氧化酶丙酮酸
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本文以一株能在胞外大量积累丙酮酸的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)四重维生素(硫胺素、生物素、吡哆醇和烟酸)的营养缺陷型菌株CCTCC M202019为研究菌株。通过:(1)添加氧化能力较强的底物葡萄糖酸钠;(2)过量表达形成水的NADH氧化酶氧化胞质中的NADH;(3)过量表达选择性氧化酶氧化线粒体内NADH等三种策略调控胞内NADH、NAD+浓度及NADH/NAD+比率,研究NADH浓度及形式对碳代谢流的流向及通量的影响。主要研究结果如下:1.好氧条件下T. glabrata能够利用葡萄糖酸钠为唯一碳源(3.5 g/L DCW),在含有90g/L葡萄糖的培养基中于16 h添加10 g/L葡萄糖酸钠,与为添加葡萄糖酸钠的对照组相比,细胞生长、葡萄糖消耗速度、丙酮酸生产强度分别提高7.96%、13.04%和32.81%。其原因在于葡萄糖酸钠的添加,使胞内NAD+浓度提高了29.73%,NADH/NAD+比率和ATP含量分别下降26.89%和8.5% ;2.将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于T. glabrata中,获得了一株NADH氧化酶活性为34.8 U/mg蛋白质的重组菌T. glabrata-PDnoxE。NADH氧化酶作用于细胞质中,将细胞质中NADH氧化为NAD+,同时生成水。与出发菌株T. glabrata相比,T. glabrata-PDnoxE发酵中NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%,而NAD+增加了11.1%,细胞浓度、葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%。发酵进行到36 h葡萄糖消耗完毕,补加50 g/L葡萄糖继续发酵20 h则使丙酮酸浓度提高到67.2 g/L;3.在T. glabrata中表达来源于荚膜胞浆菌(Histoplasma capsulatum)中编码选择性氧化酶的AOX1基因,获得一株选择性氧化酶活性为1.64 U/mg蛋白质的重组酵母T. glabrata-AOX1。选择性氧化酶存在于线粒体,在线粒体内将NADH直接氧化为NAD+,大大削弱细胞的呼吸作用。选择性氧化酶的表达,使胞内NAD+含量增加了69%,ATP含量降低了50.1%。在含有100 g/L葡萄糖的发酵培养基中,与出发菌株比较,细胞浓度降低了21.2%,葡萄糖消耗速度和丙酮酸浓度则分别增加了31.17%和38.1%。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章绪论  7-14
  1.1 概述  7-8
  1.2 Torulopsis glabrata 发酵生产丙酮酸中的糖酵解速度  8
  1.3 调控微生物细胞内NADH/NAD~+  8-13
    1.3.1 通过外源途径加速NADH 氧化再生  9-10
    1.3.2 胞内NADH 再生的实现和调控  10-11
    1.3.3 缺失竞争途径  11
    1.3.4 引入外源代谢途径  11-13
  1.4 本研究的主要内容  13-14
第二章降低胞内NADH 加强光滑球拟酵母的丙酮酸生产速度  14-21
  2.1 前言  14-15
  2.2 材料和方法  15-16
    2.2.1 菌株  15
    2.2.2 主要试剂和仪器  15
    2.2.3 培养基  15
    2.2.4 培养方法  15
    2.2.5 葡萄糖、细胞浓度(DCW)测定  15
    2.2.6 葡萄糖酸、有机酸测定  15-16
    2.2.7 NADH、NAD~+和ATP 测定  16
  2.3 结果  16-20
    2.3.1 葡萄糖酸钠为唯一碳源对T. glabrata 生长和发酵生产丙酮酸的影响  16-17
    2.3.2 葡萄糖酸钠为混合碳源时对T. glabrata 发酵生产丙酮酸的影响  17-18
    2.3.3 不同葡萄糖酸钠添加时间对丙酮酸发酵影响  18-19
    2.3.4 添加葡萄糖酸钠对T. glabrata 发酵NADH 代谢的影响  19-20
  2.4 讨论  20-21
第三章表达NADH 氧化酶对光滑球拟酵母NADH 代谢影响  21-33
  3.1 前言  21-22
  3.2 材料  22-23
    3.2.1 菌株和质粒  22
    3.2.2 主要试剂  22-23
    3.3.3 主要仪器  23
    3.3.4 培养基  23
    3.2.5 发酵培养方法  23
  3.3 方法  23-26
    3.3.1 DNA 操作  23-24
    3.3.2 PCR 扩增目的基因  24
    3.3.3 尿嘧啶缺陷型菌株的构建  24-25
    3.3.4 表达质粒pYX212-noxE 的构建  25-26
    3.3.5 酵母电击转化及筛选  26
    3.3.6 SDS-PAGE 分析  26
    3.3.7 参数测定  26
    3.3.8 ATP/NADH/NAD~+的提取和测定  26
  3.4 结果  26-32
    3.4.1 尿嘧啶缺陷型菌株的构建  26-27
    3.4.2 乳酸乳球菌noxE 基因的扩增和表达质粒的构建  27-29
    3.4.3 重组菌的构建  29
    3.4.4 过量表达NADH 氧化酶改善重组菌好氧生长性能及加速丙酮酸生产  29-32
    3.4.5 过量表达NADH 氧化酶对NADH 代谢的影响  32
  3.5 讨论  32-33
第四章表达选择性氧化酶对光滑球拟酵母NADH 代谢的影响  33-41
  4.1 前言  33
  4.2 材料  33-34
    4.2.1 菌株和质粒  33-34
    4.2.2 主要试剂  34
    4.2.3 主要仪器  34
    4.2.4 培养基  34
    4.2.5 发酵培养方法  34
  4.3 方法  34-37
    4.3.1 质粒p416-TEF 的提取  34-35
    4.3.2 目的片段的PCR 验证  35
    4.3.3 菌株T. glabrata-AOX1 的构建  35
    4.3.4 T. glabrata-AOX1 中质粒的提取  35-36
    4.3.5 T. glabrata-AOX1 的菌落PCR  36
    4.3.6 参数测定  36
    4.3.7 ATP/NADH/NAD~+的提取和测定  36-37
  4.4 结果  37-40
    4.4.1 质粒p416-TEF 的提取及AOX1 基因片段验证  37
    4.4.2 表达AOX1 的T. glabrata 重组菌构建  37
    4.4.3 重组菌的质粒提取和菌落PCR 验证  37-38
    4.4.4 表达选择性氧化酶对T. glabrata 发酵生产丙酮酸的影响  38-39
    4.4.5 过量表达选择性氧化酶对NADH 代谢的影响  39-40
  4.5 讨论  40-41
致谢  41-43
参考文献  43-46
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  46

光滑球拟酵母中NADH代谢对其酵解途径的影响

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