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辅因子与内源质粒对维生素C发酵生产的影响

作　者: 郑巧双
导　师: 陈坚
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 2-酮基-L-古龙酸稀土元素巨大芽孢杆菌质粒消除维生素C
分类号: TQ466.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本论文以普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare) WSH-001和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) WSH-002的混合菌系为生产菌株,以强化二步发酵法生产维生素C过程中2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gluconic acid,2-KLG)的高效生产和揭示两菌关系为目标,研究了稀土元素与B. megaterium为源质粒对2-KLG合成的影响。主要研究结果如下：1.通过在发酵培养基中添加不同稀土离子及稀土元素配合物,研究了稀土元素对2-KLG合成的影响,并以效果最为显著的La3+为对象进行了深入研究。结果表明,不同稀土离子在低浓度下(≤5 mmol/L)对2-KLG的合成代谢均有一定促进作用；EDTA镧、柠檬酸镧均抑制2-KLG的合成,而1mmol/L的草酸镧能轻度提高2-KLG的产量(6.4%)；在摇瓶中添加5mmol/L的La3+,发酵中后期菌体生长状况得到了显著改善,同时提高了2-KLG的最终产量,并缩短了发酵周期,分析产生这一结果的主要原因是La3+抑制2-KLG还原酶的活性,从而减少了2-KLG的降解。在发酵罐(3.6 L)中添加5mmol/L的La3+进行分批发酵,平均山梨糖消耗速率和2-KLG生产强度相比于对照分别提高了12.4%和14.8%,发酵周期缩短了11.1%。2.根据基因组测序结果,B. megaterium WSH-002中含有3个野生型质粒pBM-001、pBM-002, pBM-003,大小分别为74,613 bp,9,699 bp和7,006 bp,分别含有69、11、14个开放读码框(Open Reading Frame, ORF)。为了研究B. megaterium WSH-002内源质粒对2-KLG合成的影响,分别采用逐级升温处理法、温度和SDS交替处理法以及吖啶橙处理法对其进行了质粒消除。结果采用温度和SDS交替处理法筛选得到了两株不同的质粒部分消除衍生株D1(消除质粒pBM-001)和D13(消除质粒pBM-001和pBM-003)。最后采用吖啶橙处理法筛选得到了质粒完全消除衍生株D123。3.比较了筛选得到的三个不同质粒消除衍生株D1、D13、D123与出发菌株B.megaterium WSH-002的形态、生长特征以及分别与K. vulgare搭配后的产酸情况。结果发现,三株不同质粒消除衍生株的形态特征和生长特征与出发菌株无显著差异,说明这些质粒不是B. megaterium WSH-002生长所必须的。分别与K. vulgare搭配得到混菌体系后进行产酸比较结果表明pBM-002和pBM-003对2-KLG的合成具有重要的影响,而质粒pBM-001对2-KLG的合成几乎没有影响。根据B. megaterium WSH-002测序结果对其三个内源质粒上所有预测的96个ORF进行了COG功能分类和蛋白比对,发现WSH-002的质粒特别是pBM-002和pBM-003上存在大量未知功能蛋白或在数据库中找不到同源的蛋白。说明B. megaterium WSH-002野生型质粒的功能具有一定特殊性。

辅因子与内源质粒对维生素C发酵生产的影响

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