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Z. mobilis木糖代谢通量分析及关键酶基因的改造

作　者: 安朝光
导　师: 刘成
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 运动发酵单胞菌代谢通量分析木糖异构酶酶活测定
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

运动发酵单胞菌属于革兰氏阴性菌,微好氧生长。Z.mobilis是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种。Z.mobilis可利用的碳源仅为葡萄糖、果糖和蔗糖。利用基因工程手段改造Z.mobilis,拓宽其可利用碳源的范围,使其能利用五碳糖发酵产醇是当前运动发酵单胞菌基因工程改造工作的首要任务之一。本研究对已有的Z.mobilis重组工程菌株进行了代谢通量分析。结果表明XI、和TAL是主要的限速酶;为提高XI的酶活水平,对Z.mobilis基因表达与调控机制进行分析,通过改变相关基因终止密码子之后的序列结构,提高相关基因的表达水平。为此构建了pBSKS-Pgap-xx-L和pBSKS-Pgap-xx-S,即以E.coli染色体为模板PCR扩增片段L(xylB基因下游的一段序列,含一个转录终止子),S(xylB基因下游的一段序列,不含转录终止子),通过酶切位点HindIII和EcoT22I与质粒pBSKS-Pgap-xx连接;进而构建了穿梭质粒pZA22-Pgap-xylAB-L和pZA22-Pgap-xylAB-S,电转进Z.mobilis CP4菌株中。对基因工程菌株的XI、XK酶活测定结果表明,CP4(pZA22-Pgap-xylAB-L) XI酶活为0.195U/min/mg蛋白;XK酶活为2.159 U/min/mg蛋白,分别比出发工程菌CP4(pZA22-Pgap-xylAB-O)提高6倍和3.8倍;CP4(pZA22-Pgap-xylAB-S) XI酶活为0.0735U/min/mg蛋白;XK酶活为0.810 U/min/mg蛋白,分别比出发工程菌CP4(pZA22-Pgap-xylAB-O)提高2.3倍和1.4倍。和Z.mobilis菌株CP4相反,在DH5α中, DH5α(pZA22-Pgap-xylAB-L)的酶活水平比DH5α(pZA22-Pgap-xylAB-S)低,XI分别为0.022 U/min/mg蛋白,0.098 U/min/mg蛋白;XK分别为0.117 U/min/mg蛋白0.642 U/min/mg蛋白。结果表明终止密码子之后的序列结构对基因表达水平效果明显,但在E.coli和Z.mobilis中的作用机理不同。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章文献综述  8-26
  1.1 代谢途径分析  8-12
    1.1.1 代谢途径分析介绍  8-10
    1.1.2 代谢通量分析  10-12
      1.1.2.1 基本理论  10
      1.1.2.2 代谢通量分析应用  10-12
  1.2 木糖异构酶及木酮糖激酶的研究  12-20
    1.2.1 木糖异构酶（EC 5.3.1.5）  12-15
    1.2.2 木酮糖激酶（EC2.7.1.17）  15-17
    1.2.3 xyl基因的结构  17-19
    1.2.4 xylAB对重组菌的代谢的影响的研究  19-20
  1.3 Z.mobilis基因表达调控机制  20
  1.4 酶活测定的常用技术和方法  20-24
  1.5 本课题的研究目的及研究内容  24-26
    1.5.1 研究目的  24-25
    1.5.2 研究内容  25-26
第二章试验材料与方法  26-44
  2.1 实验材料  26-33
    2.1.1 菌株与质粒  26-27
    2.1.2 主要设备及仪器  27-28
    2.1.3 主要试剂  28-29
    2.1.4 蛋白质浓度及含量测定用试剂  29
    2.1.5 木糖异构酶酶活测定用试剂  29
    2.1.6 木酮糖激酶酶活测定用试剂  29-30
    2.1.7 培养基和补充添加物  30-31
    2.1.8 分子生物学操作常用溶液配制  31-32
    2.1.9 PCR反应用引物  32-33
  2.2 实验方法  33-44
    2.2.1 菌体培养  33
      2.2.1.1 大肠杆菌的培养  33
      2.2.1.2 Z.mobilis CP4 的培养  33
    2.2.2 考马斯亮蓝G-250 染色的方法测定蛋白质浓度  33-35
      2.2.2.1 超声波处理和粗酶液制备  34
      2.2.2.2 蛋白质浓度测定  34-35
    2.2.3 木糖异构酶酶活测定  35-36
      2.2.3.1 D-木酮糖标准曲线的测定  35-36
      2.2.3.2 木糖异构酶酶活测定  36
    2.2.4 木酮糖激酶酶活测定  36-38
    2.2.5 PCR反应  38-39
      2.2.5.1 基因组的提取  38
      2.2.5.2 引物设计与合成  38
      2.2.5.3 反应体系与反应条件  38-39
      2.2.5.4 其它  39
    2.2.6 酶切反应  39
    2.2.7 DNA琼脂糖凝胶电泳分析  39-40
    2.2.8 目的条带的回收  40
    2.2.9 核酸的乙醇沉淀纯化、回收  40
    2.2.10 脱磷反应  40
    2.2.11 连接反应  40
    2.2.12 感受态细胞的制备  40-41
    2.2.13 重组质粒大肠杆菌感受态细胞转化与转化子的筛选  41
    2.2.14 重组质粒电穿孔转化Z.mobilis CP4 和转化子的筛选  41
    2.2.15 酵母基因组DNA提取  41-42
    2.2.16 质粒的提取  42-43
    2.2.17 菌落PCR筛选CP4 转化子  43-44
第三章实验结果与讨论  44-61
  3.1 Z. mobilis（运动发酵单胞菌）木糖利用代谢通量分析  44-49
    3.1.1 Z.mobilis的生化反应网络  44-45
    3.1.2 Z.mobilis的构建代谢通量平衡模型  45-49
    3.1.3 代谢通量结果分析  49
  3.2 pZA22-Pgap-xx的构建  49-59
    3.2.1 质粒构建设计  49-51
    3.2.2 实验方法与步骤  51-59
      3.2.2.1 载体片段的制备  51-53
      3.2.2.2 E.coli染色体为模板目的片段的克隆及制备  53-55
      3.2.2.3 pBSKS-Pgap-xx-L, pBSKS-Pgap-xx-S的连接与转化  55-57
      3.2.2.4 pZA22-Pgap-xx-L、pZA22-Pgap-xx-S的构建  57-58
      3.2.2.5 CP4(pZA22-Pgap-xx-L、pZA22-Pgap-xx-S)的筛选及鉴定  58-59
  3.3 重组菌酶活测定  59-61
第四章结论  61-62
  4.1 结论  61
  4.2 建议  61-62
参考文献  62-70
附录一代谢通量分析数据引用  70-73
附录二有关质粒及染色体基因的物理图谱  73-77
致谢  77

Z. mobilis木糖代谢通量分析及关键酶基因的改造

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