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四川核桃、铁核桃的分子鉴定及其遗传多样性研究

作　者: 陈良华
导　师: 胡庭兴
学　校: 四川农业大学
专　业: 森林培育
关键词: 核桃铁核桃遗传多样性遗传结构遗传分化 AFLP RAPD 基因池
分类号: S664.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

核桃（Juglans regia L.）和铁核桃（J.sigillata Dode）均系胡桃科（Juglandaceae）核桃属（Juglans）,是重要的坚果和木本油料树种,原产中国,是古老的栽培植物之一。核桃种仁营养丰富,含有多种植物脂肪、蛋白质、不饱和脂肪酸、碳水化合物以及磷、钙、铁、钾等矿物元素和维生素B、C和E,是世界传统的坚果食品。目前,核桃研究主要集中于形态多样性研究、核桃地理生态型评价、种间关系及目标特征标记研究。但是,长期以来,核桃和铁核桃之间的种属关系存在争议,很少有人研究四川核桃资源的遗传多样性和种群遗传结构,对其遗传多样性、种群遗传结构以及它们之间的种属关系进行准确和有效的评价对于有效保护核桃种质资源、品种选育及改造核桃低产林具有重要意义。本研究采用RAPD标记技术研究核桃与铁核桃的种间关系,用AFLP技术研究四川核桃居群及铁核桃居群的遗传多样性、遗传分化和遗传结构,其主要内容及研究结果如下:（1）分别采用改进的高盐低pH法和CTAB法从核桃幼叶中提取DNA。通过琼脂糖凝胶电泳、核酸蛋白测定仪和AFLP扩增对DNA进行检测,结果表明改进高盐低pH方法得到的DNA完整性好、分子量大;OD₂₆₀/OD₂₈₀值多在1.8～1.9之间,DNA浓度较高、纯度好,扩增产物的电泳图谱清晰,适合用于核桃AFLP分析。（2）运用RAPD技术对核桃与铁核桃特征性条带进行标记。分别利用8个核桃样品和8个铁核桃样品构建两个物种的基因池,用327个随机引物,选出10个多态性引物,进一步用这10个引物进行单株确认,发现只有引物D₆在核桃类群的8个样品中扩增出一条250bp的特异带,而在铁核桃类群的8个样品中无此特异带。初步分析认为,D_6-250是核桃与铁核桃之间的特异性分子标记,该结果可为核桃和铁核桃种质鉴定提供一定的理论依据。（3）利用AFLP—银染技术,对四川干旱半干旱河谷流域的4个核桃居群和干热河谷流域的2个铁核桃居群共46个样品进行遗传多样性与亲缘关系分析。选择EcoRⅠ/MseⅠ这一酶切组合,选用多态性高、分辨力强的引物组合E32/M48、E32/M61、E33/M61、E33/M62、E35/M74、E41/M48分别对供试材料的基因组DNA进行选择性扩增,共扩增出475个遗传位点,其中332个多态位点,多态率为69.89%;核桃群体所检出的位点平均有效等位基因数Ae、Nei’s基因多样度H、平均Shannon信息指数I分别为1.2972、0.1745、0.2629,而铁核桃群体分别为1.2758、0.1616、0.2422;从种级水平来看,两物种内部居群间的遗传分化系数Gst分别为0.3794,0.2252,表明核桃群体与铁核桃群体的变异主要存在于群体内,分子方差分析（AMOVA）的结果与以上分析结果一致;运用Nei’s遗传距离对供试居群进行了UPGMA聚类及对所有样本构建了分子系统树,并进行主成分分析（PCA）,PCA分析结果与聚类分析的结果相符;从Nei’s遗传距离和遗传一致度分析了各供试资源间的亲缘关系,6个居群的UPGMA聚类图及其包含的46个样品的分子系统树一致反映了供试资源的亲缘关系:首先,核桃的四个居群与铁核桃的两个居群亲缘关系较远,在四个核桃居群中,WC（汶川—茂县核桃居群）和LD（泸定核桃居群）、HY（汉源—石棉核桃居群）、DB（丹巴—小金核桃居群）分成两个亚类,其中LD和HY显示出了最近的亲缘关系,经SPSS分析表明居群间的遗传距离与地理距离之间存在极显著的相关性(Pearson系数R²=0.847^**)。以上研究结果表明,物种的繁育系统、居群间的基因流、地理隔离是该区域核桃及铁核桃居群遗传结构形成的主要原因。综上所述,本研究中找到的核桃与铁核桃种间特征性标记D_6-250,该标记可以为核桃或者铁核桃的种质鉴定,分子辅助选择提供可能;AFLP分子标记检测到了相对较高的遗传多态性,可以作为核桃遗传图谱构建、种质鉴定和分类以及新品种保护的有效工具,另外,结合国内外相关学者的研究结果,提出了核桃育种的策略,以便充分利用核桃种质资源研究提供的信息,合理开发利用核桃种质资源,有效地进行核桃种质创新和新品种选育。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
1 文献综述  11-19
  1.1 核桃研究的生态、经济意义及核桃遗传多样性研究概况  11-12
  1.2 RAPD技术的原理、特点及应用  12-14
    1.2.1 RAPD的原理  12-13
    1.2.2 RAPD标记的特点  13
    1.2.3 RAPD用于品种鉴定  13-14
  1.3 AFLP标记的原理和特点  14-16
    1.3.1 AFLP标记的基本原理  14
    1.3.2 AFLP标记的特点  14-15
    1.3.3 AFLP在果树种质资源遗传多样性、亲缘关系鉴定、种群遗传分化研究及分子辅助育种上的应用  15-16
  1.4 分子标记在研究核桃遗传多样性、亲缘关系鉴定、种群分类上的应用  16-18
    1.4.1 RAPD在核桃种群分类上的应用  16-17
    1.4.2 RAPD在核桃种属鉴定中的应用  17
    1.4.3 RAPD技术在核桃目标性状连锁的遗传基因寻找上的应用  17-18
  1.5 国内外分子标记运用于核桃研究的动态与比较  18-19
2 本实验研究的目的和意义  19-20
3 核桃与铁核桃种间关系的RAPD鉴定  20-28
  3.1 材料与方法  20-23
    3.1.1 材料  20-21
    3.1.2 试验方法  21-23
  3.2 结果与分析  23-27
    3.2.1 提取DNA的定性定量分析比较  24-25
    3.2.2 RAPD结果分析  25-27
  3.3 讨论  27-28
4 干旱干热河谷核桃种质资源遗传多样性AFLP分析  28-45
  4.1 材料与方法  28-30
    4.1.1 材料  28-29
    4.1.2 接头、引物  29-30
  4.2 试验方法  30-35
    4.2.1 取样及DNA的制备的两种方法  30
    4.2.2 AFLP分析  30-35
  4.3 结果与分析  35-43
    4.3.1 基因组DNA双酶切、DNA片段预扩增及选择性扩增的效果  35-36
    4.3.2 不同DNA提取方法对AFLP扩增的影响  36
    4.3.3 AFLP扩增产物的多态性  36-39
    4.3.4 居群遗传多样性  39-40
    4.3.5 居群遗传分化  40
    4.3.6 居群间的遗传距离与遗传相似性、UPGMA聚类、地理距离与遗传距离之间的相关性  40-42
    4.3.7 居群个体聚类分析及主成分分析(PCA)  42-43
  4.4 讨论  43-45
    4.4.1 核桃与铁核桃种间关系探讨  43
    4.4.2 遗传多样性  43-44
    4.4.3 遗传结构与基因流  44-45
    4.4.4 核桃与铁核桃6个居群的遗传距离与聚类分析  45
5 结论  45-47
参考文献  47-51
致谢  51-53
硕士期间发表的文章  53

四川核桃、铁核桃的分子鉴定及其遗传多样性研究

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