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AAⅠ诱导的RTECs转分化相关机制的研究

作　者: 王彦英
导　师: 吴国娟
学　校: 北京农学院
专　业: 临床兽医学
关键词: 马兜铃酸Ⅰ 肾小管上皮细胞转化生长因子-β1 Smad7
分类号: S852.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

目的:探讨AAⅠ对小鼠肾小管上皮细胞的作用及TGF-β1/Smads信号转导是否参与AAⅠ诱导的上皮细胞转分化,找出AAⅠ作用的靶基因。这将有助于阐明马兜铃酸肾间质纤维化的发病机制。方法:培养小鼠原代RTECs细胞并鉴定;AAⅠ与RTECs反应后,免疫荧光染色、RT-PCR和ELISA分析CK18、波形蛋白、α-SMA和TGF-β1信号通路中分子的分布与表达变化。细胞中添加SB-431542和AAⅠ,免疫荧光染色观察细胞形态变化。Smad7启动子转染RTECs,细胞经AAⅠ处理后,双荧光素酶检测系统分析启动子活性。RT-PCR扩增Smad7的CDS区,转化后提取质粒并测序。结果:机械分离和胶原酶消化法可成功培养小鼠原代RTECs,传至第4代以后的细胞失去上皮细胞表型。高剂量的AAⅠ作用细胞后,导致细胞死亡;50ng/ml的AAⅠ随作用于细胞时间的延长,细胞形态变为纤维细胞样。免疫荧光染色结果显示,AAⅠ作用细胞后,CK18表达下调而波形蛋白和α-SMA表达上调,SB-431542可阻止这些变化。AAⅠ可促进TGF-β1和Smad2的mRNA表达,刺激细胞分泌TGF-β1,而以剂量和时间依赖方式显著抑制Smad7的转录活性。AAⅠ处理细胞后,Smad7的CDS区虽有变化但位点不固定。结论:1.本实验国内首次成功培养了小鼠原代RTECs;2.证实肾小管上皮细胞是AAⅠ作用的主要靶细胞;3. TGF-β1/Smads信号参与了AAⅠ诱导的EMT,SB-431542可抑制AAⅠ诱导的EMT;4.Smad7是AAⅠ作用的靶点之一。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章引言  10-19
  1.1 研究的目的及意义  10-11
  1.2 国内外研究现状  11-19
第二章材料与方法  19-34
  2.1 材料  19-23
  2.2 方法  23-34
第三章结果与分析  34-55
  3.1 小鼠原代RTECs培养及鉴定  34-36
  3.2 AAⅠ处理后RTECs形态学变化  36-40
  3.3 细胞总RNA 提取和RT-PCR 检测  40-44
  3.4 AAⅠ可刺激细胞分泌TGF-β1  44
  3.5 SB-431542 可以抑制AAⅠ诱导的RTECs 转分化  44-45
  3.6 转染用质粒的鉴定  45-46
  3.7 双荧光素酶系统检测结果  46-47
  3.8 AAⅠ对小鼠Smad7 基因CDS 区核苷酸序列的影响  47-55
第四章讨论  55-60
  4.1 小鼠肾小管上皮细胞原代培养  55-56
  4.2 AAI 诱导小鼠原代RTECS 转分化为肌成纤维细胞  56-57
  4.3 TGF-β1/Smads信号通路参与了AAⅠ诱导的EMT  57
  4.4 SB-431542 抑制AAⅠ诱导的EMT  57-58
  4.5 Smad7 与肾间质纤维化  58-60
第五章结论  60-61
第六章创新点  61-62
参考文献  62-68
致谢  68-69
作者简介  69

AAⅠ诱导的RTECs转分化相关机制的研究

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