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富硒酵母中硒的种态分析

作　者: 蒲云霞
导　师: 吴刚；高愈希
学　校: 内蒙古科技大学包头医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 同步辐射X射线荧光双向聚丙烯酰胺凝胶电泳反相离子对色谱-电感耦合等离子质谱种态硒富硒酵母
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

硒(selenium,Se)是人体的必需微量营养元素,是1817年由瑞典化学家J.J.Berzelius发现的,它是维持谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX )活性的重要组成成分。作为人体最重要的必需微量元素之一,硒在体内发挥着重要的生物学功能,如抗氧化、增强免疫力、抗癌、抗衰老等作用。缺硒不仅导致多种疾病的发生,如克山病、大骨节病等。而且还会影响心肌、肝脏、甲状腺等重要器官的正常功能。硒在自然界中以无机硒和有机硒两种形式存在,无论是有机硒还是无机硒都参与肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶的合成,发挥抗氧化作用。但无机硒毒性大,生物利用率低;有机硒的毒性小、生物利用率高。近年来,富含有机硒的补硒产品越来越受到研究者们的重视,如富硒酵母、富硒大蒜、富硒洋葱等。其中,富硒酵母由于富含硒蛋白合成的前体—硒代甲硫氨酸(SeMet)而成为人与动物常用的补硒产品,受到研究者的广泛关注。由于硒的生物利用率和毒性与它的化学形态密切相关,因此,正确的评价富硒酵母中硒的存化学形态及其生物学作用显得非常重要。近年来,发展了许多对富硒酵母中硒化物的提取、分离、鉴定技术,如原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)等。本文提出了一种新颖的、系统的、全面的对富硒酵母中硒化学种态的研究方法。采用双向凝胶电泳与同步辐射X射线荧光(SRXRF)非在线(off line)联用技术研究了富硒酵母中含硒蛋白的分布;对于富硒酵母中以小分子形态(Mr<5KD)存在的硒化物研究,采用了非酶解法和酶解法(链蛋白酶E)分别对水溶性的硒化物及与蛋白质结合的硒化物进行提取,采用反相离子对色谱与电感耦合等离子质谱在线(off-line)联用(RP-IP-HPLC-ICP-MS)技术,对两种小分子提取物中硒的种类和化学形态进行了定性鉴定和定量检测。对富硒酵母中的总硒采用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)进行了定量检测。另外,采用一步增溶提取法和顺序提取法对富硒酵母中高分子量的蛋白进行提取,并对蛋白的回收率进行了比较。结果表明:ICP-MS检测的富硒酵母的总硒浓度为1411.42±10.75μg g-1;一步增溶蛋白提取液经双向电泳分离、考马斯亮蓝染色后,同步辐射X射线荧光对凝胶上的蛋白质点进行扫描,共鉴定出157个含硒蛋白;对于富硒酵母中水溶性和酶解的小分子(Mr﹤5KDa)提取物的分析结果表明:水溶性的小分子硒化物中的硒占富硒酵母总硒的15.1%,其中无机硒(SeIV, SeVI)只占0.52%,经差减法得出富硒酵母中99%以上为有机硒。酶解法提取的小分子硒化物所含的硒占总硒的81.2%,硒代蛋氨酸(Se-Met)是主要存在形式,占总硒的65.26%。在富硒酵母中的一步增溶蛋白提取液和顺序蛋白提取液中,蛋白质的回收率分别为12.8%和17.6%(酵母蛋白含量约占酵母细胞干重的40%)。本文对富硒酵母中硒的种态进行了系统的研究,为以富硒酵母作为硒源的补硒产品的研究提供了很好的依据。

全文目录

主要符号表  4-5
中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
第一章富硒酵母中硒的种态分析综述  9-38
  一、富硒酵母中硒种态分析的意义  9-16
    1.1 引言  9-10
    1.2 硒的生物学功能  10-11
    1.3 硒缺乏与疾病  11-13
    1.4 硒种态分析  13-14
    1.5 富硒酵母中硒种态分析的意义  14-16
  二、富硒酵母中硒化物的提取—样品分析前处理  16-19
    2.1 引言  16
    2.2 常用硒化物的提取方法  16-19
  三、联用技术在富硒酵母硒的种态分析中的应用  19-28
    3.1 引言  19
    3.2 联用系统中的分离技术  19-25
    3.3 硒化物中硒元素的检测技术  25-27
    3.4 分子质谱对硒化物种类的鉴定  27-28
  参考文献  28-38
第二章富硒酵母中蛋白的提取及蛋白中硒含量的测定  38-53
  一、富硒酵母中蛋白质的提取  38-46
    1.1 引言  38
    1.2 实验部份  38-43
    1.3 结果与讨论  43-46
  二、富硒酵母蛋白提取液中硒含量的测定  46-51
    2.1 引言  46
    2.2 实验部份  46-48
    2.3 结果与讨论  48-51
  参考文献  51-53
第三章同步辐射 X 射线荧光（SRXRF）结合双向凝胶电泳技术分析富硒酵母中含硒蛋白的分布  53-65
  一、双向凝胶电泳分离富硒酵母中的硒蛋白  53-59
    1.1 引言  53
    1.2 实验部份  53-54
    1.3 实验方法  54-56
    1.4 结果与讨论  56-59
  二、同步辐射X射线荧光（SRXRF）检测双向凝胶电泳电泳分离后含硒蛋白的分布  59-63
    2.1 引言  59
    2.2 试验方法  59-60
    2.3 结果与讨论  60-63
  参考文献  63-65
第四章反向离子对色谱与电感耦合等离子质谱在线联用分析富硒酵母中游离的以及结合在蛋白质中的小分子硒化合物  65-77
  1.1 引言  65-66
  1.2 实验部份  66-69
  1.3 结果和讨论  69-75
  参考文献  75-77
致谢  77-78
在校期间发表论文情况  78-80

富硒酵母中硒的种态分析

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