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蜈蚣抗凝血肽的提取分离与分析

作　者: 黄能听
导　师: 王玉蓉
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中药制药学
关键词: 蜈蚣仿生酶解法抗凝 APTT 凝胶过滤色谱 C18反相色谱柱
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：研究仿生酶解法提取蜈蚣的工艺条件,探索蜈蚣酶解物中具有抗凝血作用的物质基础,进一步分离分析其组分结构,为制剂工艺提供合理依据。方法：(1)提取工艺的研究：采用活化部分凝血活酶时间(APTT)试验及纤维蛋白平板试验,以体外抗凝与纤溶活性为指标,对仿生酶解法、水提醇沉、醇提醇沉和水浸提等方法进行比较,筛选出蜈蚣的提取方法；仍以APTT实验和纤维蛋白平板实验为指标,进一步对胃蛋白酶酶解法、胰蛋白酶酶解法、仿生酶解法和复合酶解法进行比较,筛选最优的酶解方法；以水解度为指标,通过单因素考察,确定蜈蚣仿生酶解法的最佳工艺条件。(2)抗凝血肽的分离与分析：以APTT为考察指标,应用SephadexG-50、SephadexG-25凝胶过滤色谱和C18反相层析法分离蜈蚣胃蛋白酶酶解物中的抗凝血肽,并辅以高效液相色谱,MAILDIA-TOF-MASS质谱,凝胶电泳和薄层色谱等手段进行分析。结果：(1)经过提取方法和酶解方法的筛选,确定仿生酶解法为蜈蚣的提取方法,单因素考察结果确定酶解工艺为：蜈蚣药材细粉加入20倍量人工胃液,密闭,于37℃恒温水浴作用30min后,加入4.0%胃蛋白酶水解4h,将酶解液置于85℃恒温水浴作用15min,冷却至室温,以4200r/min离心15min,取上清液,干燥得蜈蚣胃蛋白酶酶解物；沉淀干燥,继加入20倍量人工肠液,密闭,于37℃恒温水浴作用30min后,加入5%胰蛋白酶水解4h,将酶解液于85℃恒温水浴作用15min,冷却至室温,以4200r/min离心15min,取上清液,干燥得蜈蚣胰蛋白酶酶解物。(2)经Sephadex G-50、SephadexG-25两次凝胶过滤色谱分离后得到一个组分F3-3,显示了很强的抗凝活性,F3-3经过C18反相色谱柱进一步纯化后,得到4个组分,其中第二组F3-3-2具有很强的抗凝效果,但并不是单一组分；(3)分离出第三组分F3-3-3,经HPLC和MAILDIA-TOF-MASS质谱法分析,为较纯物质但抗凝效果不明显。结论：仿生酶解法适于提取蜈蚣抗凝血和溶栓的有效部分,综合应用凝胶和C18反相柱可有效分离蜈蚣胃蛋白酶酶解物中的抗凝血组分,MAILDIA-TOF-MASS质谱显示,蜈蚣中的抗凝物质是小分子肽类,本研究揭示蜈蚣中起抗凝血作用的物质并非某一单一成分而是分子量在某一范围的肽类混合物。

全文目录

中文摘要  5-6
Abstract  6-8
前言  8-9
文献综述  9-37
  第一篇蜈蚣的研究进展  9-15
  第二篇肽类药物的研究进展  15-25
  第三篇酶技术及其应用进展  25-32
  参考文献  32-37
实验研究  37-89
  第一部分蜈蚣提取工艺的筛选  38-47
    第一章蜈蚣提取方法的筛选  38-43
      1 仪器与材料  38-39
      2 方法与结果  39-43
        2.1 提取工艺比较  39
        2.2 药效试验筛选  39-43
      3 小结与讨论  43
    第二章酶解方法的筛选  43-47
      1 仪器与材料  43
      2 方法与结果  43-46
        2.1 酶解方法比较  43-44
        2.2 药效试验筛选  44-46
      3 小结与讨论  46-47
  第二部分酶解工艺参数的筛选  47-60
    1 材料与仪器  47
    2 方法与结果  47-58
      2.1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度方法的建立  47-51
      2.2 水解度测定法  51-53
      2.3 酶解工艺参数筛选  53-58
    3 小结与讨论  58-60
  第三部分抗凝血肽的分离分析  60-81
    第一章凝胶过滤层析法分离分析蜈蚣肽类有效组分  60-72
      1 材料与仪器  60-61
      2. 方法与结果  61-72
        2.1 葡聚糖凝胶G-100柱层析预实验  61-65
        2.2 葡聚糖凝胶G-50柱层析  65-69
        2.3 葡聚糖凝胶G-25柱层析  69-72
    第二章 C18反向层析分离分析蜈蚣肽类有效组分  72-76
    第三章蜈蚣抗凝血肽有效组分分析  76-81
      1 TLC定性分析  76-77
        1.1 蜈蚣原药材与酶解后样品的对比TLC  76-77
        1.2 蜈蚣胃蛋白酶解物与C18馏分对比TLC  77
      2 HPLC定性分析  77-79
        2.1 蜈蚣原药材与酶解后样品HPLC定性分析  77-78
        2.2 抗凝血肽HPLC定性分析  78-79
      3 MALDI-TOF-MASS分析  79-80
      4 小结与讨论  80-81
  第四部分抗凝血肽的药效验证  81-89
    第一章离体血管环舒张实验  81-85
    第二章凝胶过滤层析法分离蜈蚣抗凝肽药效验证  85-86
    第三章 C18反向层析柱分离蜈蚣抗凝肽药效验证  86-89
全文总结  89-90
致谢  90-91
个人简历  91

蜈蚣抗凝血肽的提取分离与分析

内容摘要

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