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新型抗凝血多肽Hirulog-S的合成及质量分析

作　者: 郭会芹
导　师: 姬泓巍；戴秋云
学　校: 中国海洋大学
专　业: 应用化学
关键词: 新型抗凝血多肽 Hirulog-S 质量分析冻干粉针剂高效液相色谱法
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Hirulog-S((D)FPRP-GK(Stearic)GG-QGDFEPIPEDAYDE)是本课题组根据比伐卢定缺点和水蛭素Ⅲ型优点而设计的高效新型抗凝血多肽,其中含有一个疏水性的硬脂酸侧链。它与临床药物比伐卢定(Hirulog-1)相比具有显著优点:(1)抗凝活性是比伐卢定的10倍以上,半衰期适中(8小时),高于比伐卢定18倍(半衰期为25分钟),且作用平缓,(2)一天一次或两次静脉注射可保持很高的抗凝活性,用量低于比伐卢定10倍以上,能克服比伐卢定用量大(250 mg/瓶)、半衰期短、连续静脉滴注的缺点。用于预防溶栓后再栓塞,或深静脉血栓形成等,特别适合于PCI手术及与溶栓药共用抗凝。因此,对Hirulog-S质量分析及冻干粉针剂的研究具有非常重要的意义,为其进一步临床应用奠定基础。本论文在已有工作基础上开展了如下研究:(1)利用手工固相方法,合成了四批Hirulog-S多肽;(2)本论文参考中国药典、相关文献及书籍,建立了适合Hirulog-S原料药的质量分析方法,其质量研究工作包括理化常数测定、鉴别、纯度检验、含量测定及稳定性研究等,并建立起质量标准草案;(3)研究了Hirulog-S冻干粉针剂的配方并对其进行了质量研究和稳定性试验等。本论文取得的主要结果有:1.合成硬脂酸修饰的Fmoc-赖氨酸约54.3 g,为Hirulog-S多肽的规模合成提供了氨基酸原料。2.使用手工固相法合成Hirulog-S多肽(理论分子量2685.37 Da),采用Rink-树脂(取代率0.73 mmol/g)作为固相载体,原料为Fmoc保护的天然氨基酸,20%哌啶作为脱保护剂,HOBT/HBTU/DIEA作缩合剂,缩合完成后进行裂解得到目标产物。共合成四批,每批规模分别为5、10、10、20 mmol,粗产量分别为9.36、15.40、22.60和42.92 g,粗产率的平均值为73%。经高效液相纯化,目前已得到13.8 g。3.原料药的质量分析(1)通过对Hirulog-S多肽的氨基酸组成分析,序列测定及质谱鉴定表明它的一级结构与理论计算相符,比旋度结果表明此肽为左旋性药物。(2)通过不同色谱柱的等度洗脱和梯度探索,获得Hirulog-S分析的较理想的洗脱梯度(HPLC)。在25.4~508μg/mL范围内,以峰面积(Y)为纵坐标,样品浓度(X)为横坐标,进行线性回归,方程为:Y = 19.289 X - 175.08,R2 = 0.9990,峰面积与浓度线性关系良好。测定Hirulog-S样品中的含量及有关物质,结果三批样品(批号20100301,20100302,20100303)含量分别是99.7%±1.3%,100.4%±1.1%,99.4%±0.96%,总有关物质分别在0.59%~0.97%之间。(3)采用卡尔菲休库仑滴定法准确测定了三批样品及对照品(批号:20100304)中的水分含量。所得的结果分别为2.3%±0.05%,2.1%±0.06%,2.1%±0.11%,2.3%±0.12%,批次之间水分含量均匀。(4)采用RP-HPLC方法,进行本品中TFA含量的测定,结果分别为12.08%±0.15%,9.08%±0.14%,12.76%±0.21%,10.93%±0.08%。(5)使用硫代乙酰胺法和古蔡氏法测定重金属(Ag、Pb和As)含量均小于10 ppm,符合药物申报要求。(6)用色谱法进行了Hirulog-S稳定性试验,结果表明Hirulog-S在一定的环境下是稳定的。4.冻干粉针剂的配方研究及质量分析(1)通过筛选获得了Hirulog-S的冻干粉针剂的配方为:每瓶25 mg多肽,12.5 mg甘露醇,用0.5 M的碳酸钠调节pH为8左右,冻干得白色粉末。(2)对Hirulog-S冻干粉进行了质量分析以及稳定性研究。5.在质量研究的基础上,制订了Hirulog-S原料药质量标准草案,经检验,该标准能有效地控制产品的质量。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
0 前言  13-14
1 文献综述  14-23
  1.1 多肽合成综述  14-15
    1.1.1 液相合成的特点  14
    1.1.2 多肽固相合成的特点  14-15
    1.1.3 多肽合成  15
  1.2 多肽质量分析综述  15-21
    1.2.1 结构确证  16-18
    1.2.2 纯度分析  18-19
    1.2.3 杂质分析  19-20
    1.2.4 稳定性测定  20
    1.2.5 活性测定  20
    1.2.6 多肽制剂及分析  20-21
    1.2.7 小结  21
  1.3 本课题的研究思路  21-23
2 Hirulog-S 的规模合成  23-33
  2.1 引言  23
  2.2 试剂及仪器  23-24
    2.2.1 主要原料及试剂  23-24
    2.2.2 主要仪器  24
  2.3 方法与步骤  24-30
    2.3.1 带硬脂酸侧链修饰的赖氨酸的合成  24-26
    2.3.2 Hirulog-S 的合成  26-28
    2.3.3 Hirulog-S 的纯化  28-29
    2.3.4 Hirulog-S 粗肽及纯品的分析  29-30
  2.4 实验结果  30-31
    2.4.1 修饰赖氨酸的合成  30
    2.4.2 四批Hirulog-S 粗肽的合成  30-31
    2.4.3 Hirulog-S 的纯化  31
    2.4.4 废液处理  31
  2.5 讨论  31-32
  2.6 小结  32-33
3 Hirulog-S 原料药的质量研究及稳定性分析  33-56
  3.1 引言  33
  3.2 主要仪器及试剂  33-34
    3.2.1 主要试剂  33-34
    3.2.2 主要仪器  34
  3.3 Hirulog-S 原料药的质量研究及稳定性分析方法  34-42
    3.3.1 理化常数  34-35
    3.3.2 鉴别试验  35-36
    3.3.3 纯度分析  36-40
    3.3.4 含量测定方法的研究  40-41
    3.3.5 稳定性研究  41-42
  3.4 实验结果  42-54
    3.4.1 理化常数结果  42-44
    3.4.2 鉴别试验结果  44-46
    3.4.3 纯度检查结果  46-50
    3.4.4 含量测定结果  50-51
    3.4.5 Hirulog-S 原料药的稳定性试验结果  51-54
    3.4.6 废液处理  54
  3.5 讨论  54-55
  3.6 小结  55-56
4 Hirulog-S 制剂的质量研究及稳定性分析  56-69
  4.1 引言  56
  4.2 主要试剂及仪器  56-57
    4.2.1 主要试剂  56-57
    4.2.2 主要仪器  57
  4.3 Hirulog-S 制剂方法  57-58
    4.3.1 配方的研究  57
    4.3.2 制备工艺  57-58
    4.3.3 工艺流程图  58
    4.3.4 处方依据  58
  4.4 Hirulog-S 冻干粉的质量分析方法  58-61
    4.4.1 外观性状研究  58
    4.4.2 鉴别试验  58-59
    4.4.3 配伍稳定性试验  59
    4.4.4 渗透压的测定  59
    4.4.5 复溶性试验  59
    4.4.6 破坏性试验  59-60
    4.4.7 有关物质测定  60
    4.4.8 含量测定  60-61
  4.5 Hirulog-S 冻干粉稳定性试验方法  61-62
    4.5.1 影响因素试验  61
    4.5.2 加速试验  61-62
    4.5.3 长期试验  62
  4.6 结果与讨论  62-68
    4.6.1 配方的研究结果  62
    4.6.2 外观性状及溶解试验结果  62
    4.6.3 鉴别试验结果  62-63
    4.6.4 配伍稳定性试验结果与结论  63
    4.6.5 渗透压的测定结果  63
    4.6.6 复溶性试验结果  63
    4.6.7 破坏性试验结果  63-65
    4.6.8 有关物质测结果  65
    4.6.9 含量测定结果  65-66
    4.6.10 稳定性试验结果  66-68
  4.7 小结  68-69
结论  69-70
Hirulog-S 原料药的质量标准草案  70-72
Hirulog-S 原料药的检验报告  72-75
参考文献  75-81
附录  81-88
缩略词表  88-89
致谢  89-90
个人简历  90
发表的学术论文  90

新型抗凝血多肽Hirulog-S的合成及质量分析

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