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群体感应信号分子降解酶AiiA的分子进化研究

作　者: 李婧
导　师: 叶邦策
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 群体感应 AiiA AHLs 分子进化 CV026
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


许多细菌都能够合成并释放一种或多种信号分子,随着菌体密度的增加,信号分子的浓度也随之增加。当信号分子的浓度积累到一定阀值的时候,就会启动菌体中相关基因的表达,调控细菌的某些生物行为。在大部分革兰氏阴性致病菌中,信号分子的积累可以启动下游致病因子的表达。从苏云金芽孢杆菌Bt.4Q7中克隆得到的aiiA基因编码的AiiA蛋白可以降解群体感应信号分子,从而使得致病菌的致病性降低或者消失。AiiA蛋白的活性越高,对致病菌致病性的抑制作用也就越明显。本文通过PCR扩增,得到了aiiA4Q7、aiiA8010、aiiAWB4、aiiAWB12、aiiAT-HW3、aiiA6A3共6个aiiA同源基因；运用DNA shuffling分子进化技术,通过一步DNaseⅠ(Rnase Free)随机酶切、三轮无引物PCR、一轮有引物PCR过程,成功构建了aiiA基因突变库；以紫色色杆菌突变株CV026为报告菌,从中筛选得到了S29、S47、S21、S4、S36、S52、S7、S14、S63共9株具有较高AiiA蛋白酶活的突变株,并进一步得到了进化后的aiiAS29、aiiAS47、aiiAS21、aiiAS4、aiiAS36、aiiAS52、aiiAS7、aiiAS14、aiiAS63基因；aiiAS29和aiiAS36基因的测序结果完全相同,其余aiiA基因序列各不相同。制备了AiiAT-HW3、AiiA4Q7、AiiA8010、AiiAWB4/WB12、AiiAS29/S36、AiiAS47/S52、AiiAS21、AiiAS4、AiiAS7、AiiAS63共10个AiiA蛋白样品,通过测定各AiiA蛋白样品之间的相对酶活,得到了具有高酶活性的AiiA蛋白即AiiAs29／s36,其进化后的酶活性比原始AiiA4Q7提高了2.2倍,成功实现了对群体感应信号分子降解酶AiiA的分子进化。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-12
第1章 绪论  12-24
  1.1 群体感应  12-16
    1.1.1 群体感应现象的发现  12
    1.1.2 群体感应的类型  12-14
      1.1.2.1 革兰氏阴性菌的群体感应  12-14
      1.1.2.2 革兰氏阳性菌的群体感应  14
      1.1.2.3 种间群体感应  14
    1.1.3 信号分子及其检测  14-15
      1.1.3.1 信号分子的检测原理  14
      1.1.3.2 微生物传感菌(或质粒)的种类  14-15
      1.1.3.3 信号分子的检测方法  15
    1.1.4 群体感应的抑制  15-16
      1.1.4.1 抑制信号分子的合成  15-16
      1.1.4.2 降解信号分子  16
      1.1.4.3 抑制信号分子与调节蛋白的结合  16
  1.2 群体感应淬灭酶AiiA  16-20
    1.2.1 AiiA酶  16-19
      1.2.1.1 AiiA酶的作用机制和特性  17-18
      1.2.1.2 AiiA酶的生物学功能  18
      1.2.1.3 AiiA酶在生防及药理学上的应用  18-19
    1.2.2 AiiA酶的存在  19-20
      1.2.2.1 原核生物中的AiiA酶  19
      1.2.2.2 真核生物中的AiiA酶  19-20
  1.3 DNA改组  20-23
    1.3.1 体外分子进化的新策略  20-22
      1.3.1.1 DNA家族改组  20-21
      1.3.1.2 单链DNA家族改组  21
      1.3.1.3 部分基因片段改组  21
      1.3.1.4 简并引物基因改组  21-22
      1.3.1.5 基因组改组  22
      1.3.1.6 其他分子进化方法  22
    1.3.2 体外分子进化展望  22-23
  1.4 研究目的与意义  23-24
第2章 材料与方法  24-44
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 菌株与质粒  24
    2.1.2 药品与试剂  24-25
    2.1.3 仪器  25
  2.2 实验方法  25-44
    2.2.1 aiiA基因库的构建  26-36
      2.2.1.1 aiiA基因的扩增  26-27
        2.2.1.1.1 基因组的抽提  26
        2.2.1.1.2 aiiA基因的PCR扩增  26-27
        2.2.1.1.3 aiiA基因的割胶回收  27
      2.2.1.2 DNA Shuffling  27-31
        2.2.1.2.1 aiiA基因的DNase Ⅰ(Rnase Free)酶切  27-28
          2.2.1.2.1.1 DNase Ⅰ(Rnase Free)使用浓度的优化  28
          2.2.1.2.1.2 DNase Ⅰ(Rnase Free)酶切时间的优化  28
        2.2.1.2.2 DNase Ⅰ(Rnase Free)酶切产物割胶回收  28
        2.2.1.2.3 aiiAshuffling基因的无引物PCR  28-30
          2.2.1.2.3.1 第一轮无引物PCR  29
          2.2.1.7.3.2 第二轮无引物PCR  29
          2.2.1.2.3.3 第三轮无引物PCR  29-30
        2.2.1.2.4 aiiAshuffling基因的有引物PCR  30-31
        2.2.1.2.5 aiiAshuffling基因的PCR产物割胶回收  31
      2.2.1.3 aiiAshuffling/pET-28a(+)/BL21(DE3)的构建  31-36
        2.2.1.3.1 pET-28a(+)质粒的抽提  31-32
        2.2.1.3.2 aiiAshuffling基因和pET-28a(+)质粒的酶切、连接  32-33
        2.2.1.3.3 BL21(DE3)感受态的制备  33
        2.2.1.3.4 aiiAshuffling/pET-28a(+)的转化  33-34
        2.2.1.3.5 AiiA蛋白诱导表达  34-36
    2.2.2 高酶活AiiA蛋白的筛选  36-43
      2.2.2.1 报告菌CV026的培养  36-37
      2.2.2.2 3OC6-HSL信号分子的制备  37-40
        2.2.2.2.1 luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)的构建  37-39
          2.2.2.2.1.1 luxI基因的PCR扩增  37-38
          2.2.2.2.1.2 luxI和pET-28a(+)的酶切、连接  38-39
          2.2.2.2.1.3 luxI/pET-28a(+)的转化  39
        2.2.2.2.2 3OC6-HSL信号分子的制备  39-40
      2.2.2.3 筛选体系的建立  40
      2.2.2.4 筛选体系的优化  40
        2.2.2.4.1 产3OC6-HSL信号分子培养物体积的优化  40
        2.2.2.4.2 CV026报告菌体积的优化  40
        2.2.2.4.3 酶反应时间的优化  40
      2.2.2.5 高酶活AiiA蛋白的初筛  40
      2.2.2.6 筛选结果测序  40-41
      2.2.2.7 进化前后AiiA蛋白的氨基酸差异  41
      2.2.2.8 高酶活AiiA蛋白的制备  41-43
        2.2.2.8.1 AiiA蛋白的表达  41
        2.2.2.8.2 AiiA蛋白的纯化  41-42
        2.2.2.8.3 AiiA蛋白的复性  42-43
        2.2.2.8.4 AiiA蛋白的浓缩  43
    2.2.3 AiiA蛋白的酶活性分析  43-44
      2.2.3.1 蛋白浓度测定  43
      2.2.3.2 AiiA蛋白活性分析  43-44
第3章 结果与讨论  44-65
  3.1 aiiA基因库的构建  44-52
    3.1.1 aiiA基因的扩增  44-45
      3.1.1.1 基因组的抽提  44
      3.1.1.2 aiiA基因的PCR扩增  44-45
      3.1.1.3 aiiA基因的割胶回收  45
    3.1.2 DNA Shuffling  45-50
      3.1.2.1 aiiA基因的DNase Ⅰ(RNase Free)酶切  45-47
        3.1.2.1.1 DNase Ⅰ(RNase Free)使用浓度的优化  45-46
        3.1.2.1.2 DNase Ⅰ(RNase Free)酶切时间的优化  46-47
      3.1.2.2 DNase Ⅰ(RNase Free)酶切产物割胶回收  47-48
      3.1.2.3 aiiAshuffling基因的无引物PCR  48-49
        3.1.2.3.1 第一轮无引物PCR  48
        3.1.2.3.2 第二轮无引物PCR  48-49
        3.1.2.3.3 第三轮无引物PCR  49
      3.1.2.4 aiiAshuffling基因的有引物PCR  49-50
      3.1.2.5 aiiAshuffling基因的PCR产物割胶回收  50
    3.1.3 aiiAshuffling/pET-28a(+)/BL21(DE3)的构建  50-52
      3.1.3.1 pET-28a(+)质粒的抽提  50-51
      3.1.3.2 aiiAshuffling基因和pET-28a(+)质粒的酶切、连接  51
      3.1.3.3 BL21(DE3)感受态的制备  51
      3.1.3.4 aiiAshuffling/pET-28a(+)的转化  51
      3.1.3.5 AiiA蛋白诱导表达  51-52
  3.2 高酶活AiiA蛋白的筛选  52-62
    3.2.1 报告菌CV026的培养  52
    3.2.2 3OC6-HSL信号分子的制备  52-53
      3.2.2.1 luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)的构建  52-53
        3.2.2.1.1 luxI基因的PCR扩增  52-53
        3.2.2.1.2 luxI和pET-28a(+)的酶切、连接  53
        3.2.2.1.3 luxI/pET-28a(+)的转化  53
      3.2.2.2 3OC6-HSL信号分子的制备  53
        3.2.2.2.1 培养基的选择  53
        3.2.2.2.2 诱导温度的优化  53
        3.2.2.2.3 诱导时间的优化  53
    3.2.3 筛选体系的建立  53
    3.2.4 筛选体系的优化  53-54
      3.2.4.1 产3OC6-HSL信号分子培养物体积的优化  53-54
      3.2.4.2 CV026报告菌体积的优化  54
      3.2.4.3 酶反应时间的优化  54
    3.2.5 高酶活AiiA蛋白的初筛  54-55
    3.2.6 筛选结果测序  55-58
    3.2.7 进化前后AiiA蛋白的氨基酸差异  58-61
    3.2.8 高酶活AiiA蛋白的制备  61-62
      3.2.8.1 AiiA蛋白的表达  61
      3.2.8.2 AiiA蛋白的纯化  61-62
      3.2.8.3 AiiA蛋白的复性  62
      3.2.8.4 AiiA蛋白的浓缩  62
  3.3 AiiA蛋白的酶活分析  62-65
    3.3.1 蛋白浓度测定  62-63
    3.3.2 AiiA蛋白活性分析  63-65
第4章 结论  65-66
参考文献  66-71
致谢  71-72

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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