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APC基因沉默与TGF-β对人结直肠癌细胞粘附作用的相关性分析

作　者: 张依宁
导　师: 孙明军
学　校: 中国医科大学
专　业: 消化内科学
关键词: 人结直肠癌HCT-116细胞 APC基因 转化生长因子-β E-钙黏蛋白粘附因子 细胞粘附 细胞侵袭
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的恶性肿瘤细胞粘附作用的减弱和缺失是肿瘤转移的重要因素之一,而转移是肿瘤所致死亡的主要原因之一。而E-cadherin是上皮细胞细胞间粘附作用的主要调节因子。TGF-β信号转导通路在人类结直肠癌的发生发展中发挥着广泛的作用。了解TGF-β通路在肿瘤发生发展的特定环节中的不同作用,对遗传性结直肠癌的认识和干预提供了新的机会。WNT通路是迄今研究密度最大的通路之一,它在胚胎与肿瘤中的作用备受瞩目,而其中的Wnts、APC、axin和TCFs等都与肿瘤的发生关系密切。本研究将主要关注两个通路在人结直肠癌细胞的粘附中的作用,并探讨其可能存在的交叉调控机制。方法APC-shRNA表达质粒的构建：使用Ambion公司的在线设计软件,设计并合成能够编码针对APC基因的小发夹RNA (APC-shRNA)的寡核苷酸链模板,将其插入到pSliencerTM 4.1-CMVneo表达质粒载体中,形成pSliencerTM 4.1-CMV-APC-shRNA重组表达质粒；应用感受态细胞E.coli DH5a扩增该重组表达质粒,利用质粒的氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增；应用RT-PCR及基因测序方法筛选出插入APC-shRNA碱基序列无突变的重组表达质粒进行扩增纯化。建立HCT-116-APC-RNAi细胞模型：应用质粒提取试剂盒提取质粒,脂质体法转染人结直肠癌HCT-116细胞,应用RT-PCR及western blot检测APC基因：mRNA和蛋白表达水平,确认APC基因沉默。分别采用RT-PCR法和western blot检测APC基因沉默前后E-cadherin表达的变化；用Transwell法检测APC基因沉默前后细胞侵袭水平的变化。结果1、成功构建APC-shRNA表达质粒：含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR扩增片段大小约为250bp,并且其基因测序结果显示插入片段碱基排列顺序正确,没有突变,说明APC-shRNA表达质粒构建成功；且EGFP证明转染效率约为70～80%,说明质粒转染体系有效。2、成功建立HCT-116-APC-RNAi细胞模型：与阴性对照组相比,转染APC-shRNA质粒后48和72小时,APC基因mRNA表达水平均明显减低,表达抑制率分别为63.31±6.84%、77.03±5.61%(P<0.05)。在蛋白水平,APC蛋白在转染后的48与72小时后,抑制率为73.03±9.33%和79.51±10.13%(P<0.05)。说明APC基因沉默,HCT-116-APC-RNAi细胞模型成功建立。3、APC基因沉默对人结直肠癌HCT-116中TGF-p诱导E-cadherin作用的影响：与阴性对照组相比,APC基因沉默可抑制HCT-116细胞中E-cadherin的转录和表达,转染后48与72小时后,mRNA与蛋白抑制率为66.35±3.65%、71.32±4.57%(P<0.05)。在蛋白水平,E-cadherin抑制率为71.10±5.76%和77.54±9.16%(P<0.05)。差别具有统计学意义。4、APC基因沉默对人结直肠癌HCT-116细胞侵袭性的影响：与阴性对照组相比,APC基因沉默后,Transwell可见TGF-β对HCT-116侵袭的作用从抑制变化为促进。在对照组HCT-116细胞中,给予lOng/ml TGF-β1可以抑制约16.6%的肿瘤细胞,但是在APC沉默的HCT-116细胞中则刺激了约13.2%的肿瘤细胞侵袭。结论1、RNA干扰构建人结直肠癌细胞HCT-116的APC基因沉默模型有效可行。2、APC基因沉默可抑制TGF-p对E-cadherin的诱导作用。3、APC基因沉默可使TGF-β由促进肿瘤细胞的粘附转变为抑制。4、TGF-β通路与Wnt通路可能存在交叉调控机制。

全文目录


一、摘要  4-8
  中文论著摘要  4-6
  英文论著摘要  6-8
二、英文缩略语  8-9
三、论文  9-23
  前言  9-10
  材料与方法  10-16
  实验结果  16-19
  讨论  19-21
  结论  21-23
四、本研究创新性的自我评价  23-24
五、参考文献  24-26
六、附录  26-37
  综述  26-35
  在学期间科研成绩  35-36
  致谢  36-37
  个人简介  37

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤
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