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番茄灰霉病拮抗菌株的选育、基因改造及其发酵液大棚试验研究

作　者: 韩文霞
导　师: 朱宏莉
学　校: 西北大学
专　业: 微生物学
关键词: 番茄灰霉病芽孢杆菌穿梭质粒pBE2 发酵条件防病效果
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究首先针对样品进行了拮抗菌株的初筛和复筛。然后在此基础上对高效广谱拮抗菌进行了菌株的初步鉴定、菌株的基因改造、菌株发酵条件的优化、菌株发酵液大棚防病效果这几个方面的研究。采用样品稀释法进行拮抗菌株的分离,共获得了31株拮抗菌株。其中的一株广谱拮抗菌D2菌株,其对番茄灰霉病的抑制效果尤其明显。通过形态观察和生理生化实验进行了菌株的初步鉴定,菌株D2为芽孢杆菌属。从质粒pUC1965中得到了含有几丁质酶基因的6.5kbDNA片断,将该基因片段与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBE2连接,获得了重组质粒pBE2-chib。将重组质粒转入芽孢杆菌D2中获得了工程菌株D2-chib。几丁质平板实验和几丁质酶基因的PCR检测表明几丁质酶基因被成功转入D2菌株。构造好的工程菌株和原始菌株对番茄灰霉病的抑制率分别为91.8%,86.7%,工程菌株和原始菌株的抑病作用相比(p<0.05)有显著性差异。几丁质酶活在530nm时测定,D2-chib菌株原始粗酶液酶活(平均值)为4.06U／ml,是原始菌株酶活的33.8倍,显著地提高了菌株对番茄灰霉病的生防效果。在此基础上又对工程菌株的培养基和发酵条件进行了研究和优化,在单因素分析的基础上运用正交试验分析找到了最优的培养基和发酵条件。优化后的培养基配方为：1%葡萄糖,2%蔗糖,1%酵母膏,4%黄豆饼粉,3%麸皮,0.04%MgS04,0.4%CaCl2。各个培养基因素对发酵液影响的主次顺序为葡萄糖>蔗糖>CaCl2>麸皮>酵母膏>黄豆饼粉>MgS04。最优的发酵条件为：5%的接种量,接种种子液的菌龄为24h,摇瓶装液量30ml,发酵液初始pH7.2,最佳发酵时间为48h。各个发酵条件对发酵液活性影响的主次顺序为发酵液初始pH值>细菌接种量>种子液菌龄>摇瓶装液量。在最后试验部分本研究把工程菌株的发酵液应用到番茄温室大棚中。结果表明其抑制番茄灰霉病的效果显著,并且找到了最合适的发酵液稀释倍数,100倍的发酵稀释液对番茄灰霉病的抑病率达到91.34%。通过动态监控番茄叶面和土壤中芽孢杆菌的总数,发现芽孢杆菌可以成为优势菌群,并且在植物的生长周期中可以稳定大量存在。这提高了抑病的时效性,减少了农药的喷施和对农作物的污染。并且芽孢杆菌的安全性较好,在防病的同时还对植物有促生作用。因此,芽孢杆菌D2-chib是一株有潜在应用价值的广谱拮抗促生根际细菌。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
引言  11-12
第一章文献综述  12-24
  1 番茄灰霉病的研究进展  12-17
    1.1 番茄的简介  12
    1.2 番茄灰霉病的发生  12-14
    1.3 番茄灰霉病的防治方法  14-17
  2 拮抗微生物的研究现状  17-22
    2.1 生物防治  17-18
    2.2 拮抗微生物  18-22
  3 芽孢杆菌拮抗物质的研究  22
    3.1 蛋白类抗菌物质  22
    3.2 脂肽类物质  22
    3.3 抗菌肽类  22
  4 生物菌肥的研究  22-24
第二章番茄灰霉病广谱拮抗菌的分离筛选研究  24-33
  引言  24
  1 材料与方法  24-26
    1.1 样品采集  24
    1.2 供试植物病原真菌  24-25
    1.3 培养基  25
    1.4 仪器与设备  25
    1.5 细菌、放线菌与丝状真菌的分离  25-26
    1.6 广谱拮抗菌的初筛和复筛  26
  2 结果与分析  26-32
    2.1 拮抗菌株初筛的结果  26-29
    2.2 广谱拮抗菌株复筛的结果  29-32
  3 结论  32
  4 讨论  32-33
第三章番茄灰霉病高效拮抗菌种属的初步鉴定  33-38
  引言  33
  1 材料与方法  33-35
    1.1 菌种  33
    1.2 培养基  33
    1.3 仪器设备  33-34
    1.4 拮抗细菌的形态鉴定  34
    1.5 拮抗细菌生理生化鉴定  34-35
  2 结果与分析  35-36
    2.1 拮抗细菌的鉴定结果  35-36
  3 结论  36
  4 讨论  36-38
第四章通过导入几丁质酶基因提高菌株D2的拮抗能力  38-46
  引言  38
  1 材料与方法  38-40
    1.1 菌株和质粒  38
    1.2 酶和主要试剂  38-39
    1.3 感受态细胞制备、重组质粒构建及转化  39
    1.4 电穿孔细胞的制备及转化  39
    1.5 野生菌与工程菌对病原菌防病效果的比较  39
    1.6 菌株生长曲线及稳定性的测定  39-40
    1.7 几丁质酶酶活测定  40
  2 结果与分析  40-44
    2.1 重组质粒的构建  40-41
    2.2 电击转化  41-42
    2.3 D_2与D_2-chib对病原菌抑菌效果的比较  42
    2.4 菌株生长曲线和菌株稳定性的测定  42-44
    2.5 几丁质酶酶活测定  44
  3 结论  44
  4 讨论  44-46
    4.1 基因工程育种  44
    4.2 工程菌株的外源蛋白的表达  44-46
第五章广谱拮抗芽孢杆菌D_2-chib发酵条件的研究  46-62
  引言  46
  1 材料与方法  46-49
    1.1 菌种  46
    1.2 培养基  46
    1.3 主要试剂  46
    1.4 仪器设备  46-47
    1.5 菌体培养的方法  47
    1.6 发酵液对番茄灰霉病的抗菌活性的测定  47
    1.7 制霉菌素标准曲线的绘制  47
    1.8 培养基的优化  47-48
    1.9 发酵条件的优化  48-49
  2 结果与分析  49-60
    2.1 制霉菌素标准曲线的绘制  49-50
    2.2 发酵培养基的优化结果  50-56
    2.3 发酵条件的优化结果  56-60
  3 结论  60-61
  4 讨论  61-62
第六章工程菌株D_2-chib的大棚防病促生试验  62-68
  引言  62
  1 材料与方法  62-64
    1.1 供试作物及靶标  62
    1.2 供试生防菌株发酵液的制备  62
    1.3 试验地点  62
    1.4 试验方法  62-63
    1.5 对番茄灰霉病的防治效果研究  63
    1.6 菌株促生效果的测定  63
    1.7 工程菌株D_2-chib在叶片和土壤的定植情况  63-64
  2 结果与分析  64-67
    2.1 对番茄灰霉病的防治效果  64-65
    2.2 工程菌株D_2-chib的促生效果  65-66
    2.3 工程菌株D_2-chib在叶片和土壤中的定植情况  66-67
  3 结论  67
  4 讨论  67-68
    4.1 芽孢杆菌病原菌的定植竞争  67
    4.2 芽孢杆菌的促生作用  67-68
第七章结论与讨论  68-72
  1 主要研究成果  68
  2 主要创新点  68-69
  3 有待进一步研究的问题  69-70
  4 展望  70-72
参考文献  72-78
攻读硕士学位期间取得的学术成果  78-79
致谢  79-80
附录1  80-89

番茄灰霉病拮抗菌株的选育、基因改造及其发酵液大棚试验研究

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