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基于Tet-on系统的Osterix调控表达模型的构建和功能鉴定

作　者: 时宿妹
导　师: 孙奋勇
学　校: 暨南大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Osterix Tet-on系统 C2C12细胞株
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：利用Tet-on真核表达系统,建立DOX诱导可调控表达Osterix小鼠前成肌细胞C2C12株,并探究成骨相关转录因子Osterix的生物学功能并为进一步研究Osterix的下游基因提供有效的细胞模型。方法：PCR方法扩增得到Osterix片段并插入应答质粒pTRE中,构建pTRE-Osx重组质粒；用G418和Hyg B分步筛选建立C2C12-pTet-pTRE-Osx和C2C12-pTet-pTRE细胞株；qPCR方法摸索诱导剂DOX的最佳诱导剂量和诱导时间；MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期；钙钴法染色和茜素红染色检测成骨分化；qPCR检测成骨分化早期标志基因和其他相关基因mRNA水平的表达情况。结果：成功构建pTRE-Osx重组质粒和C2C12-pTet-pTRE-Osx和C2C12-pTet-pTRE细胞株；DOX诱导剂量为14μg／mL时Osterix的表达量最高,DOX诱导1h时Osterix的表达量开始增加,诱导18h时Osterix的表达量最大；MTT实验表明DOX诱导C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞组与对照组相比,其细胞增殖受到抑制；流式细胞术检测细胞周期结果表明DOX诱导C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞组细胞周期被阻滞在S期；钙钻法染色和茜素红染色发现C2C12-pTet-pTRE-Osx染色较空白对照组差异不明显；qPCR结果表明DOX诱导组成骨分化早期标志性蛋白基因表达均上调,Wnt信号通路拮抗物DKK1表达上调,与Osterix表达有关的Pitx2表达下调。结论：本论文成功构建在前成肌细胞C2C12中可诱导调控表达Osterix的细胞模型C2C12-pTet-pTRE-Osx,在C2C12细胞中Osterix具有抑制细胞增殖和促前成肌细胞向成骨方向分化的生物学作用。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
缩略词表  7-8
目录  8-13
一 前言  13-26
  1 文献综述  13-24
    1.1 骨的发生  13-14
    1.2 成骨细胞发展阶段  14-15
    1.3 成骨分化调控的研究和进展  15-19
      1.3.1 激素和维生素  15
      1.3.2 胰岛素样生长因子  15
      1.3.3 转化生长因子  15-16
      1.3.4 成纤维细胞生长因子  16
      1.3.5 肝细胞生长因子  16
      1.3.6 骨形态发生蛋白  16-17
      1.3.7 Runx2/Cbfal  17-19
      1.3.8 Dlx5和Dlx6  19
    1.4 Osterix的研究与进展  19-22
      1.4.1 Osterix的结构  19-20
      1.4.2 Osterix的功能  20
      1.4.3 Osterix的表达调控和研究进展  20-22
    1.5 Tet-on系统  22-24
  2 本论文的研究内容及意义  24-25
    2.1 研究内容  24
    2.2 研究意义  24-25
  3 研究思路  25-26
二 实验材料与仪器  26-31
  1 材料  26-30
    1.1 细胞株及主要试剂、试剂盒  26-27
    1.2 常用试剂及配方  27-30
      1.2.1 细胞培养试剂及配方  27-29
      1.2.2 分子克隆所用试剂及配方  29-30
  2 仪器与设备  30-31
三 实验方法  31-51
  1 pTRE-Osx重组质粒的构建  31-37
    1.1 实验设计  31-32
    1.2 PCR扩增  32-33
    1.3 切胶回收纯化PCR或酶切产物  33-34
    1.4 PCR产物和质粒的酶切  34
    1.5 载体去磷酸化反应  34-35
    1.6 连接反应  35
    1.7 大肠杆菌DH5α感受态的制备及CaCl2转化  35
    1.8 质粒抽提及单克隆的酶切鉴定  35-37
  2 Luciferase报告检测系统工作状态  37-39
    2.1 实验设计  37
    2.2 细胞复苏、培养和冻存  37
    2.3 乙醇沉淀法制备转染用质粒  37-38
    2.4 质粒转染细胞  38
    2.5 Lucifersae活性检测方法验证阳性克隆  38-39
  3 筛选C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞株  39-46
    3.1 用G418筛选C2C12-pTet细胞株  39-41
      3.1.1 做C2C12细胞的G418杀伤曲线  39
        3.1.1.1 实验设计  39
        3.1.1.2 方法和步骤  39
      3.1.2 用G418筛选稳定转染pTet质粒的C2C12细胞株  39-40
        3.1.2.1 制备细胞转染用质粒  39-40
        3.1.2.2 质粒转染C2C12细胞  40
        3.1.2.3 用G418筛选稳定转染pTet质粒的C2C12细胞株  40
      3.1.3 Luciferase活性检测方法验证阳性克隆  40-41
        3.1.3.1 实验设计  40-41
        3.1.3.2 方法和步骤  41
    3.2 用Hyg B筛选C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞株  41-46
      3.2.1 做C2C 12-pTet细胞的Hyg B杀伤曲线  41-42
        3.2.1.1 实验设计  41
        3.2.1.2 方法和步骤  41-42
      3.2.2 用Hyg B筛选稳定转染pTRE-Osx和pTRE质粒的C2C12-pTet细胞株  42
        3.2.2.1 制备细胞转染用质粒  42
        3.2.2.2 质粒转染C2C12-pTet细胞  42
        3.2.2.3 用Hyg B筛选稳定转染pTRE-Osx和pTRE质粒的C2C12-pTet细胞株  42
      3.2.3 实时定量PCR方法验证阳性克隆  42-46
        3.2.3.1 实验设计  42-43
        3.2.3.2 制备细胞样品  43
        3.2.3.3 qPCR检测  43-46
          3.2.3.3.1 检测引物设计  43
          3.2.3.3.2 总RNA抽提  43-44
          3.2.3.3.3 用DNase Ⅰ(RNase free)处理RNA  44
          3.2.3.3.4 逆转录  44-45
          3.2.3.3.5 qPCR  45-46
  4 摸索最佳诱导剂量、诱导应答时间  46-47
    4.1 摸索最佳诱导剂量  46
      4.1.1 实验设计  46
      4.1.2 制备细胞样品  46
      4.1.3 qPCR检测  46
    4.2 摸索诱导应答时间  46-47
      4.2.1 实验设计  46-47
      4.2.2 制备细胞样品  47
      4.2.3 qPCR检测  47
  5 Osterix生物学功能检测  47-50
    5.1 MTT法检测细胞增殖情况  47-48
      5.1.1 实验设计  47
      5.1.2 方法与步骤  47-48
        5.1.2.1 制备细胞样品  47-48
        5.1.2.2 MTT法检测细胞增殖情况  48
    5.2 流式细胞术检测细胞周期  48
      5.2.1 实验设计  48
      5.2.2 方法与步骤  48
        5.2.2.1 制备细胞样品  48
        5.2.2.2 流式细胞术检测细胞周期  48
    5.3 钙钴法染色检测成骨分化情况  48-49
      5.3.1 实验设计  48-49
      5.3.2 方法与步骤  49
        5.3.2.1 制备细胞样品  49
        5.3.2.2 钙钴法染色  49
    5.4 茜素红染色检测骨节结成熟度  49-50
      5.4.1 实验设计  49
      5.4.2 方法与步骤  49-50
        5.4.2.1 制备细胞样品  49-50
        5.4.2.2 茜素红染色  50
  6 qPCR检测相关基因的变化  50-51
    6.1 实验设计  50
    6.2 检测引物设计  50-51
    6.3 qPCR方法检测相关基因的变化  51
四结果与分析  51-63
  1 pTRE-Osx重组质粒的构建  51
  2 Luciferase报告检测系统工作状态  51-52
  3 筛选C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞株  52-55
    3.1 用G418筛选C2C12-pTet细胞株  52-54
      3.1.1 做C2C12细胞的G418杀伤曲线  52-53
      3.1.2 Luciferase活性检测方法验证阳性克隆  53-54
    3.2 用Hyg B筛选C2C12-pTet-pTRE-Osx细胞株  54-55
      3.2.1 做C2C12-pTet细胞的Hyg B杀伤曲线  54
      3.2.2 实时定量PCR方法验证阳性克隆  54-55
  4 摸索最佳诱导剂量、诱导应答时间  55-57
    4.1 摸索最佳诱导剂量  55-56
    4.2 摸索诱导应答时间  56-57
  5 Osterix生物学功能检测  57-63
    5.1 MTT法检测细胞增殖情况  57-58
    5.2 流式细胞术检测细胞周期  58-63
五讨论  63-67
参考文献  67-76
附录  76-80
在学期间发表论文清单  80-81
致谢  81-82

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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