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HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立

作　者: 陈娜
导　师: 付学奇；赵志虎
学　校: 吉林大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂 HTS NS5A/B EGFP
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 104次
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内容摘要


丙型肝炎病毒(HCV)感染已成为全球性的公共卫生问题,目前尚无特效药物。通过测定酶分子的活性来筛选抑制剂药物是一种新型的研究方法。由于候选药物最好可在细胞内发挥作用,因此,建立一种细胞水平上的酶活性检测系统,对于高通量筛选抗HCV药物意义重大。HCV NS3丝氨酸蛋白酶是开发抗HCV药物的常用靶点。基于此,本文初步建立了一种细胞水平的NS3丝氨酸蛋白酶活性检测方法,为进一步高通量筛选抑制剂药物做准备。本实验选择了E.coli和HeLa细胞两种模型。在原核系统中,通过质粒共转化,实现两个蛋白的共表达。在真核系统中,通过引入F2A多肽序列,将两个目的基因串联起来,瞬时转染细胞实现两个蛋白的共表达。首先,确定报告基因。在EGFP的172-173aa处插入NS5A/5B序列,记作EGFP5AB。在原核和真核系统中,实现EGFP5AB的单独表达,EGFP的N末端(1-172aa)和C末端(173-238aa)片段的共表达。荧光显微镜下观察,EGFP5AB单独表达时有绿色荧光,而EGFP的N末端和C末端片段共表达时无绿色荧光。因此原核和真核系统中,EGFP5AB均可作为报告基因。接下来,检测NS3丝氨酸蛋白酶的活性。在原核和真核系统中,分别实现NS3/4A和EGFP,NS3/4A和EGFP5AB的共表达。结果显示,NS3/4A和EGFP共表达时有绿色荧光;而NS3/4A和EGFP5AB共表达时无绿色荧光。说明NS3丝氨酸蛋白酶特异性切割了NS5A/5B位点。由此可见,报告分子的绿色荧光情况能反映NS3丝氨酸蛋白酶的活性,这为今后进一步筛选NS3蛋白酶抑制剂奠定了基础。

全文目录


内容提要  4-9
第1章 绪论  9-16
  1.1 HCV 的概况  9-11
    1.1.1 HCV 的危害  9
    1.1.2 HCV 的结构特点  9-10
    1.1.3 HCV NS3 丝氨酸蛋白酶的特点  10-11
    1.1.4 抗HCV 治疗的现状  11
  1.2 筛选NS3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的现状  11-12
    1.2.1 筛选NS3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法  11-12
    1.2.2 筛选NS3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞模型  12
  1.3 报告基因的选择  12-14
    1.3.1 GFP 的结构特点  12-13
    1.3.2 GFP 的特殊位点  13-14
    1.3.3 报告基因的要求  14
  1.4 本课题的实验目的、意义和研究策略  14-16
    1.4.1 实验目的和意义  14
    1.4.2 研究策略  14-15
    1.4.3 技术路线  15-16
第2章 实验材料和方法  16-27
  2.1 实验材料  16-18
    2.1.1 菌种和载体  16
    2.1.2 细胞系和细胞培养基  16
    2.1.3 工具酶，试剂（盒）  16
    2.1.4 试剂的配制  16-18
  2.2 实验仪器  18-19
  2.3 实验方法  19-27
    2.3.1 提取质粒DNA  19-20
    2.3.2 质粒载体的双酶切处理  20
    2.3.3 切胶回收DNA  20-21
    2.3.4 普通PCR 反应体系和条件  21
    2.3.5 重叠PCR 反应体系和条件  21-22
    2.3.6 DNA 片段的双酶切处理  22
    2.3.7 纯化PCR 产物及酶切产物  22-23
    2.3.8 连接反应  23
    2.3.9 质粒DNA 转化感受态细胞  23
    2.3.10 菌落PCR 鉴定阳性克隆  23-24
    2.3.11 感受态细胞的制备  24
    2.3.12 共转化的实现  24
    2.3.13 蛋白质的诱导表达  24
    2.3.14 SDS-PAGE 电泳  24-25
    2.3.15 制片观察  25-26
    2.3.17 细胞计数  26
    2.3.18 转染观察  26-27
第3章 原核系统中报告质粒的确定  27-43
  3.1 stGFP156-5AB 部分  27-33
    3.1.1 实验材料  27
    3.1.2 方法和结果  27-32
    3.1.3 分析和讨论  32-33
  3.2 stGFP172-5AB 部分  33-37
    3.2.1 实验材料  33
    3.2.2 方法和结果  33-37
    3.2.3 分析和讨论  37
  3.3 EGFP172-5AB 部分  37-42
    3.3.1 实验材料  37
    3.3.2 方法和结果  37-42
    3.3.3 分析和讨论  42
  3.4 小结  42-43
第4章 原核系统中NS3 丝氨酸蛋白酶的活性检测  43-49
  4.1 实验材料  43
    4.1.1 菌种和载体  43
    4.1.2 工具酶，试剂（盒）  43
  4.2 方法和结果  43-48
    4.2.1 重组质粒pET-22b-NS3/4A 的构建  43-44
    4.2.2 重组质粒pET-28a-EGFP 的构建  44-45
    4.2.3 制备感受态细胞，实现共转化  45-46
    4.2.4 SDS-PAGE 电泳  46-47
    4.2.5 制片观察荧光现象结果  47-48
  4.3 分析和讨论  48
  4.4 小结  48-49
第5章 真核系统中报告质粒的构建  49-54
  5.1 实验材料  50
    5.1.1 菌种和载体  50
    5.1.2 细胞系和细胞培养基  50
  5.2 方法和结果  50-53
    5.2.1 pcDNA3.1(+)质粒载体的双酶切处理  50
    5.2.2 重组质粒pcDNA3.1-E172_(5AB)的构建  50-51
    5.2.3 重组质粒pcDNA3.1-E172N-2A-E172C 的构建  51-52
    5.2.4 转染后观察绿色荧光现象  52-53
  5.3 分析和讨论  53
  5.4 小结  53-54
第6章 真核系统中NS3 丝氨酸蛋白酶的活性检测  54-59
  6.1 实验材料  54
    6.1.1 菌种和载体  54
    6.1.2 细胞系和细胞培养基  54
  6.2 方法和结果  54-58
    6.2.1 重组质粒pcDNA3.1-E172_(5AB)-2A-NS3/4A 表达质粒的构建  54-56
    6.2.2 重组质粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A 表达质粒的构建  56-57
    6.2.3 转染后观察绿色荧光现象  57-58
  6.3 分析和讨论  58
  6.4 小结  58-59
第7章 结论  59-60
参考文献  60-65
附录  65-68
致谢  68-69
中文摘要  69-71
Abstract  71-73

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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