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识别构象型抗原表位抗狂犬病NP单抗研究

作　者: 江燕
导　师: 罗永煌；傅振芳
学　校: 西南大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 狂犬病病毒单克隆抗体免疫荧光免疫印迹免疫沉淀抗原表位
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

狂犬病是一种古老的能引起人和动物严重的中枢神经系统病变的传染性疾病,症状一旦出现则造成致命的脑脊髓炎,无法治疗,接种疫苗是防治本病的唯—措施。为促进对狂犬病的检测、预防和诊断,以及对狂犬病病毒蛋白的结构、抗原变异、毒力、在病毒侵染、转录和复制中的功能的研究,我们将经蔗糖密度梯度纯化后的狂犬病病毒L16株作为抗原制备了抗狂犬病病毒的单克隆抗体,并对其中部分抗体做了抗原表位的鉴定。本研究分为三个部分：第一部分,狂犬病病毒的培养和纯化。本实验以狂犬病病毒L16毒株接种BSR细胞,感染96小时后,收集细胞上清,去除细胞碎片后通过蔗糖密度梯度离心进行纯化,通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定纯化的病毒蛋白。结果提示培养的细胞上清中的病毒得到了很好的富集和纯化,其病毒蛋白含量达到1.0 mg／mL。这为进一步制备单克隆抗体奠定了基础。第二部分,狂犬病病毒L16单克隆抗体的制备和鉴定。以β-丙内酯灭活纯化的L16病毒为抗原,免疫Balb／c小鼠,经初步免疫和加强免疫后,取骨髓瘤(SP／20)细胞和小鼠脾细胞进行细胞融合,并建立ELISA以及免疫荧光筛选体系,通过筛选得到了很多抗不同蛋白阳性杂交瘤株。本研究对其中4个单抗(mAb／N40、mAb／N42、mAb／N46和mAb／P49)所对应的抗原蛋白进行了进一步研究和探讨。首先将狂犬病病毒核蛋白和磷蛋白真核表达的载体通过牛痘病毒(Vaccinia virus)的辅助在BSR细胞中表达,再利用筛选出的4个单抗mAb／N40、mAb／N42、mAb／N46和mAb／P49进行免疫荧光法检测。结果发现单抗(mAb／N40、mAb／N42、mAb／N46)均识别核(N)蛋白,而另一个单抗(mAb／P49)识别磷(P)蛋白。对这四个抗体进行免疫印迹的实验发现MAb／N42和mAb／P49能识别变性的对应抗原蛋白,提示这两个单抗识别线性抗原表位；而mAb／N40和mAb／N46不能识别变性的N蛋白,提示这两个单抗识别是构象型抗原表位。第三部分,抗N蛋白单克隆抗体的抗原表位定位以及抗体的应用。为了确定上述三个抗N蛋白的单克隆抗体的抗原表位,我们构建了不同的氨基端和羧基端缺失突变型的N蛋白的质粒进行体外转录和翻译,并用上述三个抗N单克隆抗体作免疫沉淀和免疫杂交。这些免疫沉淀的分析发现mAb／N40识别的抗原表位位于126-284氨基酸的位置,而mAb／N42和mAb／N46识别的抗原表位位于284-325氨基酸的位置。这些结果提示虽MAb／N40和mAb／N46都识别构象型表位,但是它们分别识别不同构象区域,这说明mAb／N40和mAb／N46不是同一个抗体。应用这三个单克隆抗体检测了中性福尔马林固定街毒DRV和实验室毒株B2C感染的小鼠脑组织,发现只有mAb／N42有阳性反应,而mAb／N40和mAb／N46呈阴性反应,进一步证实后两者识别的是N蛋白的自然折叠的构象型表位,与免疫印迹的反应一致。这些抗体可以用来建立狂犬病诊断程序和研究狂犬病病毒蛋白结构。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第1章文献综述  11-19
  1.1 狂犬病概述  11-15
    1.1.1 简介  11
    1.1.2 狂犬病病毒的结构  11-12
    1.1.3 狂犬病病毒的分型  12
    1.1.4 狂犬病病毒的基因组  12
    1.1.5 狂犬病病毒蛋白  12-15
  1.2 狂犬病病毒的侵染、转录和复制  15
    1.2.1 侵染  15
    1.2.2 转录  15
    1.2.3 复制  15
  1.3 发病机理  15-16
  1.4 诊断  16-17
    1.4.1 内基氏小体(Negri Body)检查  16
    1.4.2 中和实验检测(MNT)  16
    1.4.3 直接免疫荧光检测(FAT)  16-17
    1.4.4 酶联免疫检测(ELISA)  17
    1.4.5 聚合酶联链式反应检测(PCR)  17
    1.4.6 快速酶免疫诊断(RREID)  17
    1.4.7 直接快速免疫组化法(DRIT)  17
  1.5 接种和预防  17-18
    1.5.1 人二倍体细胞疫苗(HDCV)  17-18
    1.5.2 原代细胞培养疫苗  18
    1.5.3 传代细胞系疫苗  18
  1.6 单克隆抗体在狂犬病研究中的应用  18-19
第2章引言  19-21
第3章狂犬病病毒的培养和纯化  21-25
  3.1 材料  21-22
    3.1.1 病毒  21
    3.1.2 实验细胞  21
    3.1.3 主要试剂  21
    3.1.4 主要仪器  21-22
  3.2 方法  22-23
    3.2.1 RV抗原的制备  22-23
  3.3 结果  23
  3.4 讨论  23-25
    3.4.1 关于病毒的滴度  23-24
    3.4.2 关于病毒纯化  24
    3.4.3 关于病毒鉴定  24-25
第4章狂犬病病毒L16单克隆抗体的制备和鉴定  25-37
  4.1 材料  25-26
    4.1.1 病毒  25
    4.1.2 质粒  25
    4.1.3 实验动物  25
    4.1.4 主要试剂  25
    4.1.5 主要仪器  25-26
  4.2 方法  26-31
    4.2.1 免疫小鼠  26
    4.2.2 筛选方法  26-28
    4.2.3 细胞融合  28
    4.2.4 细胞克隆  28-29
    4.2.5 融合细胞  29
    4.2.6 阳性杂交瘤细胞的克隆  29
    4.2.7 细胞的冻存  29
    4.2.8 细胞的复苏  29-30
    4.2.9 免疫印迹检测法  30
    4.2.10 免疫荧光对在BSR细胞中表达重组狂犬病毒N或P蛋白的检测  30-31
  4.3 结果  31-33
    4.3.1 ELISA法检测小鼠血清抗体效价  31
    4.3.2 阳性杂交瘤细胞的筛选结果  31-32
    4.3.3 免疫荧光对在BSR细胞中表达重组狂犬病病毒N或P蛋白检测的结果  32-33
    4.3.4 单抗的免疫印迹鉴定  33
  4.4 讨论  33-37
    4.4.1 关于小鼠的免疫  33-34
    4.4.2 关于筛选系统的建立  34
    4.4.3 关于细胞融合  34-35
    4.4.4 骨髓瘤细胞的选择和培养  35
    4.4.5 杂交瘤细胞的保存  35
    4.4.5 关于免疫荧光对在BSR细胞中表达重组狂犬病病毒N或P蛋白的检测  35-36
    4.4.6 关于单抗的免疫印迹鉴定  36-37
第5章抗N蛋白单克隆抗体的抗原表位的定位  37-45
  5.1 材料  37-38
    5.1.1 病毒  37
    5.1.2 实验动物  37
    5.1.3 主要试剂  37
    5.1.4 主要仪器  37-38
  5.2 方法  38-39
    5.2.1 N-和C端的缺失突变体N蛋白的构建  38
    5.2.2 体外转录和翻译  38
    5.2.3 免疫沉淀  38-39
  5.3 结果  39-41
    5.3.1 抗N蛋白的单克隆抗体识别的抗原表位定位  39-40
    5.3.2 单克隆抗体与狂犬病固定组织的反应  40-41
  5.4 讨论  41-45
    5.4.1 关于抗N蛋白单克隆抗体抗原表位的定位  41-42
    5.4.2 关于免疫组化实验检测单抗与不同毒株的反应  42-43
    5.4.3 关于抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体的应用  43-45
第6章总结  45-47
参考文献  47-53
致谢  53-55
在校期间论文发表情况  55-56

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