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蓝细菌血红蛋白基因（CHB）在细菌、酵母及植物中的功能鉴定

作　者: 李娟
导　师: 陈克平；谭小力
学　校: 江苏大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 甘蓝型油菜 CHB 促进生长速率耐涝性萌发
分类号: Q786
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

油菜作为世界范围内主要的油料作物,是食用植物油的主要来源,其饼粕是主要的饲料。近年来菜籽油作为生物能源被大量应用于化工、能源等领域,迫使人们通过不断改良油菜品质,以增加油菜产量。涝渍危害严重影响油菜正常生长发育造成减产,涝渍时间过长还会导致植物死亡从而造成绝产。因此,获得一种涝渍抗性油菜提高产量具有十分重要的意义。在微生物工业中供氧不足已成为提高产品产量的主要限制因素之一。运用基因工程改造微生物是解决上述问题的有效策略和手段。血红蛋白在动物体中的生理功能主要是结合氧并协助其运输,从而促进机体中氧的供应、呼吸链电子流量、ATP酶活力等;血红蛋白在微生物体中可以促进菌体的生长、蛋白质的合成、代谢产物的产生等。我们将蓝细菌血红蛋白基因(CHB)分别转入大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥及油菜中鉴定其功能,主要研究内容和结论如下:1.构建了原核表达载体pET30a-CHB,在大肠杆菌中进行了融合表达。Western blotting证明了pET30a-CHB在大肠杆菌BL21中表达的重组蛋白确实为His-CHB融合蛋白。分别在低氧和正常情况下测定转基因菌株和对照菌株的生长曲线,发现CHB基因能够促进大肠杆菌的生长,并能增加其稳定期的菌体量。2.构建了酵母表达载体pYES2-CHB,用RT-PCR鉴定其在酿酒酵母中的表达,测量转基因菌株和对照菌株的生长曲线,发现CHB基因能够促进酵母的生长。用气相色谱和薄层层析测定其脂肪酸含量和成份变化,结果发现转基因菌株的脂肪酸有所下降,但并没有引起磷脂的变化。3.构建了植物表达载体pCAMBIAl300-CaMV35S-CHB转化农杆菌GV3101,然后转化拟南芥,利用抗生素筛选转基因植株,PCR鉴定,得到了T3代纯系种子。在植株生长过程中,转基因植株生长比较旺盛,开花期提前,生长周期缩短。4.将植物表达载体pCAMBIA1300-CaMV35S-CHB转化农杆菌LBA4404,鉴定成功后转化甘蓝型油菜宁油16,使用抗生素浸泡种子法筛选转基因植株,RT-PCR鉴定其在油菜中的表达。CHB的表达能够使转基因植株种子提前萌发,增加耐涝力,并且能使花期提前,缩短油菜的生长周期。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
第一章绪论  14-29
  1.1 油菜生产对国民经济发展的重要性  14-18
    1.1.1 涝渍对油菜发育的影响  14-15
    1.1.2 植物转基因技术  15-16
    1.1.3 常用植物转基因方法  16-18
    1.1.4 转基因植株的筛选  18
  1.2 在工业上供氧水平对发酵的影响  18-19
  1.3 血红蛋白  19-25
    1.3.1 透明颤菌血红蛋白  19-20
    1.3.2 透明颤菌血红蛋白的作用机制  20-21
    1.3.3 透明颤菌血红蛋白在微生物代谢工程中的应用  21-23
    1.3.4 透明颤菌血红蛋白在转基因植物中的应用  23-25
  1.4 蓝细菌血红蛋白的研究进展  25-26
    1.4.1 蓝细菌概述  25-26
    1.4.2 蓝细菌血红蛋白  26
  1.5 本研究的目的和意义  26-27
  1.6 主要研究内容和技术路线  27-29
    1.6.1 主要研究内容  27-28
    1.6.2 技术路线  28-29
第二章 CHB基因在细菌中功能的鉴定  29-39
  2.1 材料和试剂  29-31
    2.1.1 微生物材料  29
    2.1.2 试剂  29
    2.1.3 基本溶液的配制  29-31
    2.1.4 主要仪器设备  31
  2.2 方法  31-35
    2.2.1 蓝细菌CHB基因的克隆  31
    2.2.2 引物设计及PCR反应  31-32
    2.2.3 目的片段的回收  32-33
    2.2.4 连接反应  33
    2.2.5 大肠杆菌感受态的制备  33
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的热击转化  33
    2.2.7 SDS-碱裂解法小量抽提质粒DNA  33-34
    2.2.8 CHB基因在大肠杆菌中的表达  34
    2.2.9 Western印迹  34-35
    2.2.10 细菌生长曲线的测定  35
  2.3 结果与分析  35-38
    2.3.1 CHB基因原核表达载体的构建  35-36
    2.3.2 CHB在大肠杆菌中的表达与Western blot检测  36
    2.3.3 CHB基因促进细菌的生长  36-38
  2.4 讨论与总结  38-39
第三章 CHB基因在酵母中功能的鉴定  39-49
  3.1 材料和试剂  39-40
    3.1.1 微生物菌种、载体  39
    3.1.2 试剂  39
    3.1.3 基本溶液及培养基  39-40
    3.1.4 酵母培养基  40
  3.2 方法  40-45
    3.2.1 酵母表达载体的构建  40-41
    3.2.2 酵母感受态细胞的制备  41
    3.2.3 重组质粒转化酵母感受态细胞  41-42
    3.2.4 酵母总RNA的提取  42
    3.2.5 反转录  42-43
    3.2.6 酵母生长曲线的测定  43
    3.2.7 酵母的油脂含量及成分的检测  43-45
  3.3 结果与分析  45-48
    3.3.1 CHB基因酵母表达载体的构建  45-46
    3.3.2 CHB在酿酒酵母pep4中的表达  46
    3.3.3 CHB基因促进酵母的生长  46-47
    3.3.4 CHB对酿酒酵母油脂含量及成分的影响  47-48
  3.4 讨论与总结  48-49
第四章 CHB基因在拟南芥中功能的鉴定  49-59
  4.1 材料和试剂  49-50
    4.1.1 植物材料、菌种  49
    4.1.2 试剂  49
    4.1.3 基本溶液及培养基  49-50
  4.2 方法  50-54
    4.2.1 农杆菌感受态细胞的制备  50
    4.2.2 冻融法转化农杆菌感受态细胞  50-51
    4.2.3 阳性克隆的鉴定和保存  51
    4.2.4 重组质粒pCAMBIA1300-CaMV35S-CHB向拟南芥的转化  51-52
    4.2.5 转基因拟南芥的筛选  52
    4.2.6 组培苗的炼苗移栽  52-53
    4.2.7 拟南芥基因组DNA的小量抽提  53-54
    4.2.8 转基因拟南芥的PCR鉴定  54
  4.3 结果与分析  54-58
    4.3.1 CHB基因植物表达载体的构建  54
    4.3.2 重组质粒pCAMBIA1300-CaMV35S-CHB转化农杆菌的鉴定  54-55
    4.3.3 转基因拟南芥的筛选  55-56
    4.3.4 PCR鉴定转基因植株  56
    4.3.5 转基因植株的表型分析  56-58
  4.4 讨论与总结  58-59
第五章 CHB基因在油菜中功能的鉴定  59-74
  5.1 材料和试剂  59
    5.1.1 植物材料、菌种  59
    5.1.2 试剂  59
    5.1.3 仪器设备  59
  5.2 实验方法  59-65
    5.2.1 浸花法转化油菜  59-61
    5.2.2 转基因油菜的筛选  61-62
    5.2.3 植物总RNA的提取  62
    5.2.4 除去RNA中的基因组DNA  62-63
    5.2.5 RT-PCR  63-64
    5.2.6 种子萌发试验  64
    5.2.7 水涝耐受力的测定  64
    5.2.8 植物叶绿素的测定  64-65
  5.3 结果与分析  65-72
    5.3.1 CHB基因植物表达载体的构建  65
    5.3.2 重组质粒pCAMBIA1300-CaMV35S-CHB转化农杆菌的鉴定  65
    5.3.3 转基因植株的筛选  65-68
    5.3.4 PCR鉴定转基因植株  68
    5.3.5 CHB在甘蓝型油菜宁油16中的表达  68-69
    5.3.6 种子萌发试验  69-70
    5.3.7 种子在萌发过程中脂肪酸含量的测定  70
    5.3.8 水涝耐受力的测定  70-72
    5.3.9 植物叶绿素的测定  72
  5.4 讨论与总结  72-74
第六章总结与展望  74-76
  6.1 主要工作总结  74
  6.2 工作展望  74-76
参考文献  76-82
致谢  82-83
在学期间发表论文  83
在学期间发表专利  83
参加课题  83

蓝细菌血红蛋白基因（CHB）在细菌、酵母及植物中的功能鉴定

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