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小反刍兽疫病毒H基因与IFN-γ基因共表达质粒的构建

作　者: 邵长春
导　师: 张强
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 甘肃农业大学 硕士学位论文 重组质粒 免疫佐剂 真核表达质粒 细胞免疫 疫苗免疫 抗体水平 基因 共刺激分子
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、烈性、接触性传染病,因危害严重被世界卫生组织列为A类传染病。2007年我国首次报道发生PPR疫情,PPR疫情在我国周边国家及境内的不断发生对我国动物疫病的防控提出了新的要求,对PPR的诊断和预防成为研究热点。本实验选取了小反刍兽疫病毒H作为免疫原基因,并以共刺激分子IFN-γ基因为佐剂基因来构建真核表达载体,利用BHK-21细胞、小鼠作为模型研究核酸疫苗在BHK-21细胞中表达、诱导小鼠体液免疫和细胞免疫的能力、IFN-γ的免疫增强作用,获得如下结果:1.小反刍兽疫H基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中表达:小反刍兽疫H基因的克隆,本研究对小反刍兽疫H基因进行pGEM一T载体克隆与测序。通过NotⅠ和XholⅠ双酶切,定向粘末段连接法,用pBudce4.1载体构建了真核表达载体pBud-H和pBud-IFN-γ/H。用脂质体法将pBud-H和pBud-IFN—γ/H分别转染BHK-21细胞,通过荧光抗体检测,目的基因在BHK-21细胞中获得了表达。2.核酸疫苗诱导小鼠体液和细胞免疫的研究:pBud-H和pBud-IFN-γ/H分别免疫4周龄雌BALB/c小鼠,2周后加强免疫一次,每周用ELISA检测小鼠血清中的抗体水平,隔周用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖反应,结果表明DNA疫苗均可有效引发机体产生体液免疫和细胞免疫,而且pBud-IFN-γ/H的免疫产生的抗体水平以及细胞免疫水平都比pBud-H要高,结果表明,小反刍兽疫H基因作为抗原基因是可行的,IFN-γ发挥了免疫佐剂的作用增强了DNA疫苗的免疫原性,是一种很良好的免疫佐剂。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-8
第一部分 文献综述  8-26
  第一章 小反刍兽疫的研究进展  8-16
    1.1 流行概况  8
    1.2 理化特征  8
    1.3 小反刍兽疫病毒基因组结构  8
    1.4 小反刍兽疫病毒的结构蛋白  8-9
    1.5 易感动物及临床症状  9-10
    1.6 诊断  10-12
    1.7 防制  12-16
  第二章 DNA疫苗免疫佐剂的研究进展  16-26
    2.1 细胞因子  16-20
    2.2 共刺激分子  20-22
    2.3 CpG DNA基序  22-23
    2.4 脂质体  23-24
    2.5 结束语  24-26
第二部分 实验部分  26-47
  第三章 PPRV-H基因真核表达质粒的构建及其在BHK-21细胞中表达  26-38
    3.1 材料  26-28
      3.1.1 菌种和载体  26
      3.1.2 主要试剂  26-27
      3.1.3 引物  27
      3.1.4 培养基  27
      3.1.5 溶液  27
      3.1.6 仪器与设备  27-28
    3.2 方法  28-34
      3.2.1 目的片段的克隆与鉴定  28-31
      3.2.2 H基因亚克隆至真核质粒pBudce4.1  31-32
      3.2.3 真核共表达的构建  32-33
      3.2.4 重组质粒在BHK细胞中的表达  33-34
    3.3 实验结果  34-36
      3.3.1 pGEM-H重组质粒的构建  34
      3.3.2 pGEM-H重组质粒的PCR及酶切鉴定  34-35
      3.3.3 重组真核表达质粒pBud-H的构建  35
      3.3.4 真核共表达质粒pBud-H的PCR及酶切鉴定  35
      3.3.5 重组真核表达质粒pBud-IFN-H的构建及鉴定  35-36
      3.3.6 DNA疫苗在BHK细胞中的表达情况(图6)  36
    3.4 小结  36-38
  第四章 PPRV-H质粒免疫小鼠试验  38-47
    4.1.材料  38-39
      4.1.1 主要试剂  38
      4.1.2 溶液  38-39
    4.2 方法  39-40
      4.2.1 动物免疫实验  39
      4.2.2 免疫小鼠血清特异性抗体测定  39-40
      4.2.3 MTT试验检测细胞免疫  40
    4.3 结果  40-44
      4.3.1 小鼠免疫后血清抗体检测结果  40-41
      4.3.2 细胞免疫检测结果  41-44
    4.4 讨论  44-47
      4.4.1 载体构建  44
      4.4.2 动物实验  44-47
参考文献  47-56
致谢  56-57
作者简历  57-59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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