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六株细脚拟青霉原生质体制备和染色体核型研究

作　者: 徐莉
导　师: 李春如；樊美珍
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 细脚拟青霉无性型原生质体脉冲电泳核型分析
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 69次
引　用: 2次
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内容摘要

本文对5株来自不同产地的细脚拟青霉的产孢条件、最佳酶解条件、原生质体制备工艺和6株菌株脉冲电泳条件进行了研究,主要结果如下。不同的菌株在不同的培养基、不同温度下培养2周后,产孢量和菌丝生长量都有显著差异,最佳产孢光照时间也各不相同,实验的结果为:pt165在查氏培养基上,27℃中黑暗培养产孢最好;pt173的产孢量和菌丝量的最佳条件可选取在PDA上,29℃光照2d产孢;pt208在查氏上,23℃光照培养6d产孢最好;pt223在查氏上,23℃光照培养6d产孢最好;pt45在PDA上,27℃下较长时间的光照产孢较好。菌丝获取方法的不同会对菌丝酶解效果产生很大的影响,结果表明:选取液体种子转接入新鲜的培养基中,萌发一段时间后摇瓶中的菌丝生长阶段不一致,造成同样酶解时间下原生质体量的不同,使后续的实验难以进行。取长势一致的孢子悬浮液接入液体摇瓶中,孢子萌发情况一致,酶解效果很好,且实验也容易定量控制。不同的菌株孢子萌发时间也对酶解效果产生很大影响,孢子浓度筛选实验结果为:pt165在孢子浓度为107个∕ml浓度时,菌丝萌发的时间比孢子浓度为108个∕ml以上时菌丝萌发时间短,酶解效果也比孢子浓度大的酶解效果好,其他菌株结果也一致。不同的菌株由于各自细胞壁的成分有或多或少的差别,所以酶解的最佳酶解体系和最佳浓度也有差别。pt165在2%蜗牛酶+2%纤维素酶的组合下酶解4h效果最好,可以达到15.04×106个∕ml以上;pt173和pt45在该组合浓度下的酶解效果也很好,酶解时间分别为3.5h、4h后产生原生质体量分别可以达到15.6×106个∕ml, 25.88×106个∕ml;pt208在2%蜗牛酶+2%溶壁酶组合下酶解3.5h效果最好,最后结果可以达到15.12×106个∕ml;pt223在该组合浓度下酶解3.5h效果也很好,可以达到9.23×106个∕ml。菌株在不同酶解体系下,酶解获得原生质体量的最佳时间也不一致。实验发现,纤维素酶的作用效果要缓慢一些,同样酶解条件下,有纤维素酶的参与酶解的最佳时间会稍微偏长一些,但是产生的原生质体量会最终超过其他酶解体系,所以可以根据不同的实验目的选择不同的酶解体系,本实验是选择酶解时间较短的最佳酶解体系和浓度。不同的酶解温度也会对酶解效果产生很大的影响。本实验选择的几个温度梯度下筛选的结果为:pt165,pt208和pt223都在37℃酶解效果最好,温度升高或降低酶解效果都降低;pt45和pt173都在29℃时酶解效果最好。电泳条件筛选过程中,电泳总时间、脉冲时间、电压和角度,及缓冲液均对电泳结果产生影响。不同的菌株具有长度多态性,染色体条带的分子量有差别,电泳条件也会有很大变化,经过多次筛选所得结果为:电泳的第1阶段总时间为48h,温度为14℃,电泳液为1×TAE,0.8%的胶,电压为2v/cm,脉冲时间为20～30min,转换角度为106o;第2阶段总时间为16h,温度为14℃,电泳液为1×TAE,0.8%的胶,电压为3v/cm,脉冲时间为500s,转换角度为106o。经过对筛选条件后得到的条带分析发现:不同菌株染色体数目和长度多态性很明显,详细结果为pt173,pt223有5条或者5条以上的染色体条带,pt45有6条或者6条以上的条带,pt97和pt208至少有7条大小不同的染色体条带,以Mb为单位,其大小分别为:pt165跑出来的条带约为5.56、3.77、3.11、2.87、2.44、0.31,估计核型大小至少约为18.06Mb;pt97条带大小约为5.78、4.70、3.94、3.28、2.88、2.45、0.43,其中上往下数第2条条带异常明亮,估计是的2条或者2条以上的条带重合所致,所以其核型大小至少约为25.91Mb;pt223条带大小约为5.75、3.05、2.90、2.80、2.29,估计核型大小约为16.79Mb;Pt208条带大小约为5.37、4.49、3.50、2.99、2.72、2.46、0.44,估计核型大小约为21.97Mb;pt173电泳条带分子量大小约为5.89、3.75、3.06、2.91、2.29,核型大小至少约为17.9Mb;pt45电泳条带约为6.04、3.96、3.15、2.98、2.75、0.49,但从电泳图上可观察到从上往下第1、2、4条亮度和宽度都很大,估计有2条以上条带重合,核型大小至少为25.76Mb。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
文献综述  11-23
  1 微生物原生质体制备技术的研究进展  11-16
    1.1 原生质体制备的基本过程  11-15
      1.1.1 菌龄  11-12
      1.1.2 酶的种类  12
      1.1.3 酶的浓度  12-13
      1.1.4 酶解的温度  13
      1.1.5 酶解的时间  13
      1.1.6 酶解的pH 值环境  13
      1.1.7 渗透压稳定剂  13-14
      1.1.8 其他因素的影响  14-15
    1.2 虫生真菌原生质体体制备技术的研究进展  15-16
      1.2.1 白僵菌原生质体制备方面的研究  15
      1.2.2 拟青霉原生质体制备条件的研究  15
      1.2.3 其他真菌的原生质体制备研究进展  15-16
  2 脉冲场电泳技术的研究进展  16-23
    2.1 脉冲场电泳条件和原理的研究  16-18
      2.1.1 样品的制备  16
      2.1.2 脉冲电泳条件的相关研究  16-18
    2.2 脉冲场电泳技术的发展和应用  18-23
      2.2.1 在遗传和分子生物学方面的研究  18-20
      2.2.2 在分类鉴定中的应用  20-21
      2.2.3 脉冲电泳存在的问题  21
      2.2.4 脉冲电泳的前景和展望  21-23
1 引言  23-25
2 实验材料和方法  25-30
  2.1 材料  25-26
    2.1.1 菌种来源  25
    2.1.2 培养基  25
    2.1.3 实验试剂  25
    2.1.4 所需溶液的配制  25
    2.1.5 酶液的配制  25-26
    2.1.6 主要仪器  26
  2.2 方法  26-30
    2.2.1 产孢结构的观察  26
    2.2.2 产孢条件的筛选  26-27
    2.2.3 原生质体的制备  27-28
    2.2.4 样品胶块的制备  28-29
    2.2.5 电泳条件的筛选  29-30
3 结果与分析  30-48
  3.1 供试的细脚拟青霉菌株的确认  30-31
  3.2 产孢培养基的筛选  31-39
    3.2.1 培养基对菌株生长和产孢的影响  31-34
    3.2.2 温度对菌株生长和产孢的影响  34
    3.2.3 光照时间对菌株的影响  34-39
  3.3 酶解所需菌丝获得方法的选取  39
  3.4 孢子浓度对萌发时间和菌丝酶解的影响  39-41
  3.5 酶解条件的筛选  41-43
    3.5.1 酶体系的筛选  41
    3.5.2 酶浓度的筛选  41-42
    3.5.3 温度对菌丝酶解的影响  42
    3.5.4 酶解最佳时间的筛选  42-43
  3.6 酶解过程中的原生质体照片  43
  3.7 电泳条件的筛选  43-48
4 讨论  48-52
  4.1 培养条件对孢子产生量的影响  48
  4.2 菌龄对实验的影响  48
  4.3 酶解条件与原生质体生成量的关系  48-49
  4.4 原生质体过滤对实验的影响  49-50
  4.5 样品中的杂蛋白的影响  50
  4.6 电泳条件的选择  50-52
5 结论  52-54
参考文献  54-62
致谢  62-63
作者简介  63
发表的论文  63

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