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GIT2参与NF-κB信号通路的负调控

作　者: 黄晓碧
导　师: 汪思应；杨晓明
学　校: 安徽医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: NF-κB 蛋白质相互作用 GIT2 去泛素化
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

核转录因子NF-κB(NF-κB)在炎症、免疫、细胞应激和凋亡中扮演重要的角色。NF-κB经典途径的激活依靠其抑制亚基IκBα的磷酸化,而IκBα是由一个大分子量的多聚复合物调节的,即IκB激酶复合体。IKK激酶复合体是由两个催化亚基IKKα和IKKβ和一个调节亚基NEMO/IKKг(NF-κB essential modulator)组成。NEMO是IKKs和NF-κB激活所必须的分子,但是它的活性机制还没有完全阐明。研究与NEMO相互作用的蛋白质对于阐明IKK激酶复合体的活化机制、NF-κB信号通路的激活机制都具有十分重要的意义。因此,我们以NEMO为诱饵,用酵母双杂交技术从胎肝文库中分离到了与NEMO相互作用的蛋白质GIT2 (GPCR-kinase interacting proteins 2),同时,我们以GIT2为诱饵,筛选到的猎物发现有4种分子直接参与NF-κB信号通路激活的调控,包括NEMO、TRAF1 ( TNF receptor-associated factor 1 )、TNFAIP3(tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3)和TNIP1(TNFAIP3 interacting protein 1)。GITs蛋白是近年来发现的具有脚手架功能的一类蛋白质,它们在细胞骨架的形成,膜的转运等过程中都具有重要的功能,并且作为多种信号传导通路的接头分子,前期实验表明,GIT2与NF-κB信号通路中许多关键的蛋白分子具有相互作用,我们推测GIT2有可能参与NF-κB信号通路,因此,我们以GIT2基因为主要研究对象,发现与之相互作用的蛋白,探讨其影响NF-κB的分子机制。我们采用PCR技术构建了NEMO、GIT2的原核表达载体和A20、TRAF1、TNIP1的真核表达载体及GIT2的截短体,并检测其在原核细胞和真核细胞中均表达相应的蛋白。在过表达的情况下,我们利用免疫沉淀实验确证GIT2与NEMO、TRAF1和TNIP1具有相互作用;且GIT2与NEMO相互作用的位点可能是GIT2的ARFGAP、PBS结构域和NEMO的CC结构域,确定了GIT2(1-347 aa)与TRAF1存在相互作用。GST pull-down实验表明GIT2与NEMO存在相互作用。我们通过转录活性实验发现,在过表达的情况下,GIT2、A20、TRAF1和NEMO均可以抑制NF-κB的转录活性,并且A20、TRAF1均可以和GIT2协同抑制NF-κB的转录活性;而TNIP1却可以促进NF-κB的转录活性。GIT2可以抑制TRAF2介导的NF-κB的转录活性,但不可以抑制IKKβ诱导的NF-κB的转录活性。利用GIT2、A20和NEMO内源抗体检测了细胞中GIT2、A20和NEMO的表达,发现HEK293细胞中有GIT2、A20和NEMO的表达,并用Western blot和RT-PCR的方法检测了在HEK293细胞中A20siRNA和GIT2siRNA具有一定的干涉效果。通过复合体实验表明,GIT2可以促进A20与NEMO的结合。另外,我们在HEK293细胞中过表达和敲减GIT2发现GIT2可以促进A20使NEMO发生去泛素化,进而调控NF-κB的下游靶基因的转录。但GIT2调控NF-κB的分子机制还需要进一步的确证。总之,我们筛选到的NEMO的相互作用蛋白GIT2在NF-κB信号通路中起重要的作用, GIT2作为一种新的调节NF-κB信号通路的分子,为研究NF-κB的调控机制提供了新的线索。

全文目录

主要英文缩写一览表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
主要仪器设备和常用试剂的配制  11-15
论文正文 GIT2参与NF-κB信号通路的负调控  15-62
  前言  15-19
  1. 材料与方法  19-32
  2. 结果  32-53
  3. 讨论  53-57
  结论  57-58
  参考文献  58-62
附录1 构建成功的基因基本信息  62-63
附录2 本人简历及在学期间的研究成果  63-64
致谢  64-66
综述  66-73

GIT2参与NF-κB信号通路的负调控

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