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重金属镉人工抗原的合成与抗镉单克隆抗体的制备

作　者: 张云显
导　师: 刘发央
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 野生动植物保护与利用
关键词: 镉 单克隆抗体 ELISA 抗原 双功能螯合剂 细胞融合
分类号: X50
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 143次
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内容摘要


重金属是有毒和对环境有持久污染的物质,它并不像碳源污染物那样能完全降解为无毒的物质,而仅仅是通过一些有限的生物的或化学过程进行转化。这些转化对一些特定的金属只是限制其毒性或可溶性,一些金属通常竞争过程重新循环,最终又恢复到原来的毒性状态.在环境中金属离子长时间结合在土壤中或沉淀物中,这些结合的金属除了对下层生长的动物外都相对无毒。但天气的变化、土壤或水中pH值或环境的结合都能够使金属发生移动,从而大大提高了它们的可利用性和高效的毒性。目前镉的检测方法仍然依赖传统仪器,但免疫检测方法具有检测快速、费用低、易于操作、易懂、简单易携、而且高灵敏性和可选择性等特点,近年来日益受到国内外广泛的关注。本研究以匙孔血蓝蛋白(KLH)与镉离子通过双功能鳌合剂乙二胺四乙酸( Ethylenediamine Tetraacetic Acid , EDTA)偶联,获得完全抗原KLH-EDTA-Cd,用二喹啉甲酸(BCA)法测抗原浓度,对抗原进行紫外分光光度计扫描,利用SDS-PAGE电泳进行定性鉴定,用石墨炉原子分光吸收法检测抗原中镉离子的含量,结果为Cd-DTPA-OVA、Cd-EDTA-KLH、HEPES中的镉离子含量依次为:34.6±0.3μg/mL,96.5±0.5μg/mL, 0μg/mL,通过以上几种方法,证明重金属镉螯合物人工抗原合成成功。以该抗原免疫BALB/C小鼠,应用杂交瘤技术,经酶联免疫吸附测定法筛选及有限稀释法亚克隆化,最终获得了3株可稳定分泌抗重金属镉的杂交瘤细胞株(D11-2, F6-5和H9-8)。其中杂交瘤细胞株D11-2, F6-5和H9-8细胞培养上清液效价分别达1:200, 1:400, 1:800,腹水效价分别达1:2000,1:4000, 1:8000。本研究制备的抗镉单克隆抗体,为建立农产品和环境中重金属镉的快速免疫检测技术莫定了基础。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
第一部分 文献综述  9-32
  1 重金属污染来源  10-13
    1.1 土壤中的重金属污染来源  10-11
    1.2 水体中重金属污染来源  11
    1.3 大气中重金属污染来源  11-13
  2 重金属污染的危害  13-17
  3 重金属污染的防治  17-20
  4 重金属样品的前处理方法  20-21
  5 传统重金属残留检测方法  21-22
  6 重金属免疫检测方法  22-30
    6.1 小分子免疫检测技术基本原理  23-25
      6.1.1 免疫学基本原理  23-25
      6.1.2 小分子免疫检测的基本原理  25
    6.2 重金属免疫原及其特异性单克隆抗体的制备  25-27
      6.2.1 重金属抗原的制备  25-26
      6.2.2 重金属特异性抗体的制备  26-27
    6.3 抗原分子中螯合剂的结构在抗体识别抗原中的作用  27-29
      6.3.1 重金属抗原制备过程中螯合剂的选择  27-28
      6.3.3 金属离子-螯合剂复合物三维结构的差异对抗体识别能力的影响  28-29
      6.3.4 金属离子-螯合剂复合物的价态对抗体识别抗原的影响  29
    6.4 重金属免疫学检测技术  29-30
      6.4.1 重金属间接竞争ELISA 免疫检测法  29
      6.4.2 重金属KinExA 免疫检测方法  29-30
      6.4.3 一步竞争性重金属免疫检测法  30
      6.4.4 荧光偏振重金属免疫检测  30
  7 研究重金属免疫检测技术的意义  30-32
第二部分 研究内容  32-51
  重金属镉螯合物人工抗原的合成与鉴定  32-39
    1 材料与方法  32-34
      1.1 材料与试剂  32-33
      1.2 仪器设备  33
      1.3 抗原的合成  33
        1.3.1 Cd-DTPA-OVA 和Cd-EDTA-KLH 的制备  33
        1.3.2 无金属抗原DTPA-OVA 和EDTA-KLH 的制备  33
      1.4 抗原的鉴定  33-34
        1.4.1 抗原的浓度测定  33-34
        1.4.2 半抗原、抗原与载体蛋白的紫外光谱  34
        1.4.3 抗原SDS-PAGE 电泳  34
        1.4.4 抗原中镉离子的含量  34
    2 结果  34-37
      2.1 BCA 法检测抗原的浓度  34
      2.2 紫外扫描载体蛋白和抗原的图谱  34-36
      2.3 抗原SDS-PAGE 电泳  36-37
      2.4 石墨炉原子吸收光谱法检测抗原中镉离子的含量  37
    3 讨论  37-39
  重金属镉单克隆抗体的制备  39-51
    1 材料与方法  39-48
      1.1 试剂及主要仪器  39-42
        1.1.1 主要试剂材料  40
        1.1.2 主要仪器设备  40-41
        1.1.3 常用试验溶液、主要培养液和缓冲液的配制  41-42
      1.2 重金属完全抗原的制备  42
        1.2.1 免疫抗原及包被抗原的制备  42
      1.3 动物免疫  42-43
      1.4 抗镉单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立  43-48
        1.4.1 Sp2/0 骨髓瘤细胞的复苏  43-44
        1.4.2 免疫脾细胞的制备  44
        1.4.3 细胞融合  44-45
        1.4.4 阳性杂交瘤细胞的筛选  45-46
        1.4.5 阳性杂交瘤细胞的克隆化  46-47
        1.4.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏  47
        1.4.7 单克隆抗体的大量制备  47-48
    2 结果与分析  48
      2.1 小鼠血清效价测定  48
      2.2 杂交瘤细胞株建立  48
      2.3 杂交瘤细胞株的冻存及复苏  48
      2.4 单克隆抗体的大量制备  48
    3 讨论  48-51
      3.1 重金属镉免疫抗原的制备  48-49
      3.2 单克隆抗体制备过程中的几个重要环节  49-50
      3.3 杂交瘤技术  50
      3.4 重金属抗体的间接竞争ELISA  50
      3.5 单克隆抗体的大量制备  50-51
参考文献  51-56
常用名词缩略语  56-57
致谢  57-58
个人简介  58-59
导师简介  59

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境污染及其防治 > 一般性问题
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