学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

高浓度皮质醇介导慢性心理应激和动脉粥样硬化的炎症机制研究

作　者: 赵莉
导　师: 赵玉霞
学　校: 山东大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 应激，心理学动脉硬化氢化可的松炎症小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子
分类号: R543
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 203次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

背景心血管疾病是严重威胁人类生命健康的常见病和多发病。其危险因素有很多,如高脂血症、高血压、糖尿病、肥胖、吸烟等。但流行病学研究表明:大约40%的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的病人与上述危险因素无关,而与慢性心理应激密切相关。与AS相关的心理应激主要有负性情感、焦虑情绪、工作紧张等诸多心理社会应激。因此,进行心理应激与AS的相关研究在AS的预防和治疗中具有深远的意义。目前,AS的发病机制有三种比较公认的学说,即脂质浸润学说、血栓形成学说和内皮损伤反应学说。国内外已有不少关于慢性心理应激与这三种学说的相关关系的研究,但迄今为止,这些研究都无法清楚地解释慢性心理应激是如何影响AS的发生、发展、结局。因此,这个领域期待着新的思路。近年来,炎症学说在AS的发病机制中越来越重要。这个学说认为:AS是发生在动脉壁上的慢性炎症反应,AS每一步特征性的损害代表着慢性炎症反应的不同阶段。而长期慢性心理应激不仅降低了内源性抗炎物质—皮质醇的抗炎效果,而且还扩大了炎症反应,从而促进了动脉壁的损伤。然而,高浓度的皮质醇是通过促进了哪些炎症因子的分泌,进而加速了AS的发生发展呢?此外,在心理应激导致AS的不同阶段,这些炎症因子的浓度变化趋势是怎样的?要研究这些问题,首先要建立慢性心理应激诱发AS的动物模型。建立这种模型需要满足两个条件:首先要有出现动脉粥样硬化病灶的可能性,其次要可操作性强,能便于动态观察动物的行为变化。但目前还没有成熟的动物模型。因此,我们需要建立与人类慢性心理应激病变特征相似的慢性心理应激动物模型,并检测其血清中与AS密切相关的炎性因子单核细胞趋化蛋白-(monocte chemoattractantprotein-1,MCP-1),巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF),肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)等的水平,观察这些炎症因子在心理应激导致AS的不同阶段的浓度变化趋势,以及这种变化趋势是否与高浓度的皮质醇密切相关。目的(1)建立与人类长期慢性心理应激病变特征相似,易于动态观察慢性心理应激对动脉粥样硬化影响的动物模型。(2)比较心理应激诱导的AS和高脂饮食诱导的AS不同阶段的炎症因子浓度变化趋势。(3)筛选出既与皮质醇浓度变化密切相关,又与AS密切相关的炎性因子。方法1.实验分组健康雄性纯种新西兰大白兔160只,随机分为正常对照组(A组)、高脂组(B组)、慢性心理应激组(C组)和高脂加慢性心理应激组(D组)各40只。A组、C组给予普通颗粒饲料喂养,B组、D组给予含1%胆固醇的高脂饲料喂养。实验周期为16周。2.动物模型的建立对C组和D组的80只实验兔进行慢性不可预见性心理应激:第一天噪音刺激3 h,第二天旋转60 min(80转/min),第三天狗惊吓60 min(在一个放狗的大笼子里加一道栅栏,将其一分为二,狗不能钻过栅栏,一边放狗,一边放兔子),第四天把兔子放进塑料网兜悬挂4 h,第五天足底电击60 min(110 v,1次/min),第六天断水24 h,第七天断食24 h,以七天为一个周期,下一个周期在上一个周期的基础上增加10 min。实验周期共为16周。3.动物模型的评价(1)于实验前和实验后每4周分别记录所有实验兔饮食量,体重,血压,心率,血清皮质醇和炎症因子的水平。(2)于实验前和实验结束后,观察并记录所有实验兔自我修饰行为的变化。4.血脂检测分别于实验开始、4周、8周、12周及16周末采血做血液生化检查。采用酶联法测定血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(high-densitylipoprotein cholesterol,HDL-C)水平。5.血清皮质醇及炎性因子的检测分别于实验开始、4周、8周、12周及16周末采血,应用酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测血清皮质醇(corticosterone,CORT)、高敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。6.高频体表超声检查分别于实验开始、8周末、12周末、24周末行腹主动脉高频体表超声检查。测量动脉舒张末期内径(end-diastolic luminal diameter,Dd)、动脉收缩末期内径(end-systolic luminaldiameter,Ds)、腹主动脉后壁内膜-中层厚度(Intima-Media Thickness,IMT)、腹主动脉收缩期血流峰值速度(peak velocity,Vp)、收缩期平均速度(mean velocity,Vm)和收缩期流速积分(velocity integral,VTI)。将内-中膜平均回声强度AⅡ-Ⅰ与外膜平均回声强度AⅡ-A的比值作为内-中膜校正的AD值(AⅡc%),AⅡc%=AⅡ-Ⅰ/(AⅡ-A)×100%。7.病理染色留取腹主动脉标本,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,油红O(red-oil O)染色。8.免疫组织化学染色行TNF-α、MIF、ET-1、CRP、eNOS、MCP-1及IL-10免疫组织化学染色。9.Real-time PCR检测血管组织中TNF-α、ET-1、CRP、eNOS、MCP-1及IL-10的mRNA表达水平,并以管家基因GAPDH作为参照。10.Western blot检测血管组织中TNF-α、ET-1、CRP、eNOS、MCP-1及IL-10的蛋白表达水平。11.统计学分析连续性数据用(?)±SD表示,离散数据用例数和百分数表示。组内比较服从正态分布的资料采用t检验,非正态分布资料采用秩和检验,组间差异性比较采用单因素方差分析,应用SPSS统计软件进行统计学处理(version 13.0;SPSS Inc),P＜0.05有统计学差异。结果1.实验动物的基本情况进入实验阶段的160只实验兔中,慢性心理应激组有3只实验兔死亡,慢性心理应激加高脂组有4只实验兔死亡,分别死于肠胀气和呼吸道感染。最终完成药物干预实验兔的共153只,其中对照组40只,高脂组40只,慢性心理应激组37只和慢性心理应激加高脂组36只。本文对完成药物干预的153只实验兔的资料进行分析。2.慢性心理应激兔模型的评价2.1实验开始及实验开始后每4周各组实验兔饮食的变化。与正常对照组相比,实验开始后慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组饮食量显著降低(P＜0.05);与高脂组相比,实验开始后慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组饮食量显著降低(P＜0.05);高脂组和正常组之间及慢性应激组和慢性心理应激加高脂组之间均无统计学意义(P＞0.05)。2.2实验开始及实验开始后每4周各组实验兔体重变化。与正常对照组相比,实验开始后慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组体重显著降低(P＜0.05);与高脂组相比,实验开始后慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组体重显著降低(P＜0.05);高脂组和正常组之间及慢性应激组和慢性心理应激加高脂组之间均无统计学意义(P＞0.05)。2.3实验开始及实验开始后每4周各组实验兔血压变化。与正常对照组相比,实验开始后高脂组、慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组血压均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与高脂组相比,从第8周开始慢性应激组和慢性心理应激加高脂组血压均显著升高(P＜0.05);慢性应激组和慢性心理应激之间血压无统计学意义(P＞0.05)。2.4实验开始及实验开始后每4周各组实验兔心率变化。与正常对照组相比,实验开始后慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组心率显著升高(P＜0.01);高脂组和正常组之间及慢性应激组和慢性心理应激加高脂组之间均无统计学意义(P＞0.05)。2.5实验前后各组实验兔自我修饰动作的变化。与正常对照组相比,实验结束后慢性应激组和慢性应激加高脂组实验兔实验后的每小时的自我修饰动作明显减少(P＜0.05);正常对照组和高脂组的实验兔在实验前后每小时自我修饰行为的变化无统计学意义(P＞0.05)。2.6实验开始及实验开始后每4周血脂水平的变化。与正常对照组相比,高脂组、慢性心理应激组、慢性心理应激加高脂组的血脂均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与高脂组相比,慢性心理应激组的血脂明显降低(P＜0.05),慢性应激加高脂组的血脂明显升高(P＜0.05)。与慢性心理应激组相比,慢性应激加高脂组的血脂明显升高(P＜0.05)。2.7实验开始及实验开始后每4周血清皮质醇的变化。4周末,与正常对照组相比,高脂组、慢性心理应激组、慢性心理应激加高脂组的血清皮质醇均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与高脂组相比,慢性心理应激加高脂组的血清皮质醇显著升高(P＜0.05);与慢性心理应激组相比,慢性心理应激加高脂组的血清皮质醇显著升高(P＜0.05):高脂组和慢性心理应激组之间无统计学意义(P＞0.05)。8周、12周、16周末,与正常对照组相比,慢性心理应激组、慢性心理应激加高脂组的血清皮质醇均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与高脂组相比,慢性心理应激组、慢性心理应激加高脂组的血清皮质醇均显著升高(P＜0.05);慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组之间无统计学意义(P＞0.05)。2.8实验开始及实验开始后每4周血清hs-CRP的变化。与正常对照组相比,高脂组、慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的血清hs-CRP明显升高(P＜0.05,P＜0.01);与高脂组相比,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的血清hs-CRP明显升高(P＜0.05,P＜0.01);与慢性心理应激组相比,慢性心理应激加高脂组的血清hs-CRP明显升高(P＜0.05)。2.9实验开始及实验开始后每4周血清TNF-α的变化。4周末,与正常对照组相比,高脂组,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的TNF-α水平均明显升高(P＜0.05);与高脂组相比,慢性心理应激加高脂组的TNF-α水平明显升高(P＜0.05),慢性心理应激组与高脂组之间无统计学意义(P＞0.05);与慢性心理应激组相比,慢性心理应激加高脂组的TNF-α水平明显升高(P＜0.05);8周到16周,与正常对照组相比,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的TNF-α水平均明显升高(P＜0.05);高脂组与正常组无统计学意义(P＞0.05);慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组之间无统计学意义(P＞0.05)。3.高频体表超声与正常对照组相比,高脂组,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的IMT和AⅡc%显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与高脂组相比,慢性心理应激组的IMT和AⅡc%显著降低(P＜0.05),慢性心理应激加高脂组与高脂组之间无统计学意义(P＞0.05);与慢性心理应激组相比,慢性心理应激加高脂组的IMT和AⅡc%显著升高(P＜0.05);各组间血流速度检测值无统计学意义(P＞0.05)。4.病理染色油红O染色结果显示,高脂喂养4周动脉壁开始有脂质沉积,8周有明显的脂肪条纹形成,12周斑块内开始有脂滴形成,16周斑块进一步增大有脂质池出现。慢性心理应激组则是8周动脉壁开始有脂质沉积,12周到16周才出现明显的脂肪条纹。HE染色显示,动脉粥样斑块在12周到16周形成,与正常对照组相比,高脂组,慢性心理应激组和高脂加慢性心理应激组均有斑块形成(P＜0.05);同一时间比较,高脂组斑块明显比慢性应激组的大(P＜0.05);慢性应激加高脂组的斑块与高脂组的无统计学意义(P＞0.05)。5.免疫组织化学染色与正常对照组相比,三个实验组eNOS表达均明显减少(P＜0.05);IL-10,TNF-α,MIF和ET-14周时明显增加(P＜0.05);CRP和MCP-1 12周和16周时明显增加(P＜0.05)。与高脂组相比,8周到16周,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组TNF-α明显升高(P＜0.05);慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组之间无统计学意义(P＞0.05);高脂组与正常对照组无统计学意义(P＞0.05)。6.Real-time PCR与正常对照组相比,高脂组,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的eNOS mRNA水平均显著降低(P＜0.05,P＜0.01),组间比较无统计学意义(P＞0.05);IL-10和ET-1 mRNA水平均明显升高(P＜0.05,P＜0.01),组间比较无统计学意义(P＞0.05);MCP-1 mRNA水平均明显升高(P＜0.05,P＜0.01),8周到16周慢性应激加高脂组和慢性应激组的MCP-1mRNA水平均明显高于高脂组(P＜0.05),12周到16周慢性应激加高脂组的MCP-1 mRNA水平明显高于慢性应激组(P＜0.05);CRP mRNA水平均明显升高(P＜0.05,P＜0.01),慢性应激加高脂组和慢性应激组CRP mRNA水平明显高脂组(P＜0.05,P＜0.01),慢性应激加高脂组的CRP mRNA水平明显高于慢性应激组(P＜0.05)。4周末,TNF-αmRNA水平均明显升高(P＜0.01),组间比较无统计学意义(P＞0.05);8周到16周,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的TNF-αmRNA水平均明显高于高脂组(P＜0.01);高脂组与正常组之间无统计学意义(P＞0.05);慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组之间无统计学意义(P＞0.05)。7.Western blot与正常对照组相比,高脂组,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的eNOS蛋白水平均显著降低(P＜0.05,P＜0.01);与高脂组相比,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的eNOS蛋白水平均显著降低(P＜0.05);与慢性心理应激组比较,慢性心理应激加高脂组的eNOS蛋白水平显著降低(P＜0.05);与正常对照组相比,ET-1,IL-10,MCP-1和CRP蛋白水平均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与高脂组相比,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的ET-1,IL-10,MCP-1和CRP蛋白水平水平均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与慢性心理应激组比较,慢性心理应激加高脂组的ET-1,IL-10,MCP-1和CRP蛋白水平水平显著升高(P＜0.05)。与正常对照组相比,4周末,高脂组,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的TNF-α蛋白水平均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与高脂组相比,8周到16周,慢性心理应激组和慢性心理应激加高脂组的TNF-α蛋白水平水平均显著升高(P＜0.05,P＜0.01),高脂组和正常组之间无统计学意义(P＞0.05),慢性心理应激和慢性心理应激加高脂组之间无统计学意义(P＞0.05)。结论(1)建立了与人类长期慢性心理应激病变特征相似,易于观察慢性心理应激对动脉粥样硬化影响的动物模型。(2)炎症因子MCP-1,TNF-α和CRP在慢性心理应激诱导的AS的过程中均呈上升趋势,MCP-1和CRP在高脂饮食诱导的AS的过程中均呈上升趋势,TNF-α在第4周末明显升高,但是在第8周末开始下降,第12周至16周逐渐回复正常水平。(3)筛选出了既与高浓度皮质醇变化密切相关,又与AS密切相关的炎性因子TNF-α。背景流行病学研究表明:长期慢性心理应激是促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生发展的一个重要危险因素,但其机制目前仍不清楚。与其他应激激素相比,长期慢性应激时血清中的皮质醇浓度能反映应激的情绪的性质。临床研究表明抑郁患者的皮质醇和炎症的血清水平均远远高于健康人。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)是一种主要由活化的巨噬细胞产生的糖蛋白,是应激反应过程中产生的细胞因子,可激发细胞因子级联效应,诱导TNF-α自身及白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)等其他细胞因子的聚集和炎性介质的释放。研究表明:长期慢性的心理应激可以促使血清中TNF-α明显升高;同时TNF-α的升高使最初的炎症信号不断放大,更多的单核细胞聚集、浸润,最终导致AS病变的发生和发展。本实验第一部分已经证实体内TNF-α的变化趋势与皮质醇浓度变化密切相关。TNF-α主要是由巨噬细胞分泌的,那么,在体外,不同浓度的皮质醇对巨噬细胞分泌TNF-α有无影响?其趋势如何?目的(1)观察不同浓度皮质醇对巨噬细胞分泌TNF-α的影响;(2)观察不同时间皮质醇对巨噬细胞分泌TNF-α的影响。方法为观察不同浓度,不同时间皮质醇对巨噬细胞分泌TNF-α的影响,本实验通过体外培养小鼠巨噬细胞,将不同浓度的皮质醇(0 ng/mL、675ng/mL、1250ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL、10000 ng/mL)分别孵育2h、4h、8h、12h、24h后,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,并用western-bolt的方法检测各组TNF-α的蛋白表达水平。结果倒置显微镜下观察,正常的巨噬细胞生长状态良好,贴壁较牢,呈多边形或圆形,形态饱满,呈铺路石状生长,细胞间连接紧密,分裂较多,未见悬浮细胞。皮质醇损伤组可见不同程度及范围的细胞收缩、变圆、胞间隙变宽、细胞脱壁悬浮。皮质醇浓度在675-1250ng/mL时,小鼠巨噬细胞TNF-α蛋白表达明显升高(P＜0.01);皮质醇浓度高于1250ng/mL时,TNF-α蛋白表达开始下降(P＜0.05)。随着时间的延长,小鼠巨噬细胞TNF-α蛋白表达水平呈现上升趋势,刺激时间以24小时时,小鼠巨噬细胞TNF-α蛋白表达最为明显(P＜0.05)。结论(1)皮质醇浓度在675-1250ng/mL时,小鼠巨噬细胞TNF-α蛋白表达明显升高,为本实验最佳刺激浓度。(2)随着时间的延长,小鼠巨噬细胞TNF-α蛋白表达水平呈现上升趋势,以24小时时升至最高。

全文目录

论文Ⅰ 高浓度皮质醇介导慢性心理应激和动脉粥样硬化的炎症机制研究  6-74
  中文摘要  6-13
  英文摘要  13-23
  符号说明  23-25
  前言  25-27
  材料和方法  27-40
  结果  40-44
  讨论  44-48
  结论  48-49
  参考文献  49-53
  附图表  53-74
论文Ⅱ 不同浓度皮质醇对巨噬细胞TNF-α蛋白表达水平的影响  74-90
  中文摘要  74-76
  英文摘要  76-78
  符号说明  78-79
  前言  79-80
  材料和方法  80-84
  结果  84
  讨论  84-85
  结论  85-86
  参考文献  86-87
  附图表  87-90
致谢  90-91
攻读硕士学位期间发表的文章  91-92
学位论文评阅及答辩情况表  92

高浓度皮质醇介导慢性心理应激和动脉粥样硬化的炎症机制研究

内容摘要

全文目录

相似论文