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茶枝柑皮多糖提取、分离纯化、结构及抗氧化活性研究

作　者: 陈思
导　师: 黄庆华
学　校: 广东药学院
专　业: 药物分析
关键词: 茶枝柑皮多糖 提取 纯化 柱前衍生高效液相色谱 结构分析 抗氧活性
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


茶枝柑皮是茶枝柑（Citrus reticulata‘Chachi’）的成熟果皮,果皮晒干陈化后,便成了广东道地药材——广陈皮。茶枝柑皮主要是药用（作为广陈皮）、制成调味品及凉果,除了含有挥发油、黄酮外,茶枝柑皮还含有丰富的果胶多糖,历来对茶枝柑皮未进行深加工,造成资源的浪费。本论文以茶枝柑皮为原料,利用现代分离分析手段,对茶枝柑皮果胶多糖的提取、纯化工艺、单糖组成的测定方法、化学结构及其体外抗氧化活性进行了较系统的研究,以期为茶枝柑资源的开发利用提供科学依据和利用途径。1.采用酸水提醇沉法提取茶枝柑皮粗多糖（CCP）。单因素试验确定各因素（提取溶剂pH值、料液比、提取温度和时间）对多糖得率和抗氧化能力影响的合适水平,并用正交试验进一步优化。经试验得出CCP的最佳提取工艺为:用pH4的酸水、料液比为1:30、提取温度90℃、提取时间90min,在此条件下多糖得率和抗氧化FRAP值分别为18.9%和48.9。粗提多糖膨胀力和持水力均较高,并属于高酯果胶多糖。2.将CCP通过树脂脱色和Sevag试剂去除蛋白,得到纯化的多糖CP。通过静态吸附法,考察了大孔吸附树脂、离子交换树脂对CCP溶液的脱色率,由于D-201阴离子交换树脂脱色效果优于其它树脂,故选择D-201树脂作为CCP的脱色树脂,并进一步研究了D-201树脂的最佳脱色工艺:脱色温度40℃,树脂用量8%（m/v）,转速75r/min振荡2h。Sevag法除蛋白则需在反复萃取6～9次后,达到蛋白去除率为74%。3.采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）作为还原醛糖的标识分子,柱前衍生化高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）和普通C18柱,建立了8种常见单糖的快速分析鉴别技术,并且确定了单糖的衍生化条件及多糖CP的水解条件。CP用2 mol/L的三氟乙酸（TFA）在120℃烘箱中水解2h得到各单糖,单糖在70℃下与PMP衍生化反应40min后用1:1（v/v）氯仿涡旋萃取3次。流动相20%（v/v）乙腈-磷酸盐缓冲溶液（pH 7.1）、流速1.0 mL/min、等度洗脱即可实现单糖的良好分离。方法学考察结果表明,各单糖的相关系数、精密度、重复性、回收率均良好。4.对纯化后的茶枝柑皮多糖CP采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析进行分离得到4个组分,分别命名为CPN、CPA-1、CPA-2、CPA-3,将CPA-1、CPA-2、CPA-3进一步用Sephadex G-100凝胶排阻层析纯化得到对应的CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ、CPA-Ⅲ。经TSK G-5000 PWxL、TSK G-3000 PWxL柱高效凝胶色谱分析,证实CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ、CPA-Ⅲ具有较高的纯度,其重均分子量分别为8.0×104 Da、2.6×105Da、2.4×105Da。红外光谱结果表明,CPN是带有结晶水的吡喃多糖,CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ和CPA-Ⅲ均是部分羧酸甲酯化的α-半乳糖醛酸多聚糖。NMR结果推测茶枝柑皮多糖主链是由（1→4）-α-GalpA构成,存在部分半乳糖醛酸甲酯化,半乳糖、鼠李糖、甘露糖等以α-吡喃糖形式存在于末端或侧链。单糖组成分析表明,CPN中单糖的摩尔比是Man: Rha: GalA: Glc: Gal: Xyl: Ara =0.34: 0.07: 5.30:1:4.71:0.61:14.7;CPA-Ⅰ的单糖摩尔比是Man: Rib: Rha: GalA: Glc: Gal: Ara = 0.12: 0.04: 0.74: 39.33: 1: 8.48: 24.05;CPA-Ⅱ的单糖摩尔比是Man: Rib: Rha: GalA: Glc: Gal: Ara=0.94: 0.05: 1.33: 56.65: 1: 7.04: 19.38;CPA-Ⅲ的单糖摩尔比是Man: Rha: GalA: Glc: Gal: Ara=2.02: 1.98: 122.66: 1: 8.85: 26.26。5.通过体外模拟试验,采用MTT法首先筛选了H2O2致U251细胞损伤的最佳成模浓度,是0.1875mmol/L;再研究了茶枝柑皮粗多糖（CCP）对过氧化氢损伤的U251细胞的保护作用,在试验浓度2.500-0.078mg/mL范围内呈剂量依赖关系;CCP脱蛋白后的多糖则未表现出抗氧化活性。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
第1章 绪论  11-21
  1. 糖类物质的定义、分类  11
  2. 多糖的提取和纯化  11-14
    2.1 多糖的提取  11-13
    2.2 多糖的纯化  13-14
  3. 多糖的单糖组成测定方法  14-18
    3.1 单糖组成的气相色谱法  14-15
    3.2 单糖组成的高效液相色谱法  15-18
  4. 多糖化学结构表征方法  18-19
    4.1 多糖结构的化学分析法  18-19
    4.2 仪器分析法  19
  5. 研究目的与主要研究内容  19-21
第2章 茶枝柑皮多糖提取工艺研究  21-33
  1 材料与仪器  21-22
    1.1 材料  21
    1.2 仪器  21-22
  2 方法  22-27
    2.1 原料处理  22
    2.2 茶枝柑皮多糖提取工艺流程  22-23
    2.3 粗多糖中总糖含量测定  23-24
    2.4 粗多糖体外总抗氧化能力的测定  24
    2.5 粗多糖提取综合评分  24
    2.6 多糖得率及抗氧化能力单因素试验  24-25
    2.7 多糖得率及抗氧化能力的正交试验  25
    2.8 验证试验  25-26
    2.9 茶枝柑皮多糖的理化性质分析  26-27
  3 结果与讨论  27-31
    3.1 粗多糖体外总抗氧化能力的测定  27
    3.2 各因素对多糖得率及抗氧化能力的影响  27-29
    3.3 正交试验结果  29-30
    3.4 苯酚‐硫酸法测定粗多糖中总糖含量  30
    3.5 茶枝柑皮粗多糖的理化性质分析结果  30-31
  4. 本章小结  31-33
第3章 茶枝柑皮多糖的纯化  33-42
  1. 材料与仪器  33-34
    1.1 材料  33
    1.2 仪器  33-34
  2 方法  34-37
    2.1 树脂脱色  34-36
    2.2 脱蛋白  36-37
  3 结果与讨论  37-40
    3.1 树脂筛选的结果  37-38
    3.2 单因素试验结果  38-39
    3.3 正交试验结果  39-40
    3.4 验证试验结果  40
    3.5 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量  40
  4 本章小结  40-42
第4章 柱前衍生化HPLC 测定单糖组成分析方法的建立  42-54
  1 材料与仪器  42-43
    1.1 材料  42
    1.2 仪器  42-43
  2 方法与结果  43-53
    2.1 溶液制备  43
    2.2 色谱条件  43-44
    2.3 方法学考察  44-48
    2.4 多糖水解条件与单糖衍生化条件考察  48-51
    2.5 色谱分离条件的优化  51-53
  3. 本章小结  53-54
第5章 茶枝柑皮多糖的系统分级及结构初步研究  54-68
  1 材料与仪器  54-55
    1.1 材料  54-55
    1.2 仪器  55
  2 方法  55-58
    2.1 茶枝柑皮多糖（CP）的离子交换柱层析  55-56
    2.2 茶枝柑皮多糖CP 的凝胶柱层析  56-57
    2.3 高效凝胶渗透色谱法测定分子量  57
    2.4 紫外光谱扫描  57
    2.5 红外光谱分析  57-58
    2.6 核磁共振分析  58
    2.7 单糖组成分析  58
  3 结果与讨论  58-66
    3.1 茶枝柑皮多糖离子交换层析  58-60
    3.2 茶枝柑皮多糖组分的凝胶柱层析  60
    3.3 单糖组成分析  60-61
    3.4 茶枝柑皮多糖组分的紫外扫描光谱  61-62
    3.5 红外光谱分析  62-64
    3.6 高效凝胶渗透色谱  64-65
    3.7 核磁共振  65-66
  4. 本章小结  66-68
第6章 茶枝柑皮多糖抗氧化活性研究  68-74
  1 材料与仪器  68-69
    1.1 材料  68
    1.2 仪器  68-69
  2 方法  69-71
    2.1 溶液配制  69
    2.2 药物配制  69
    2.3 U251 细胞培养  69
    2.4 茶枝柑皮多糖、脱蛋白多糖对人神经胶质瘤细胞U251 损伤保护作用研究  69-70
    2.5 统计分析  70-71
  3. 结果与讨论  71-73
    3.1 筛选H_20_2 最佳成模浓度  71-72
    3.2 茶枝柑皮多糖对H_20_2 损伤的U251 细胞的保护作用  72-73
  4 本章小结  73-74
第7章 结论与展望  74-76
参考文献  76-84
攻读学位期间发表的论文  84-85
附录  85-92
致谢  92

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