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获得性重型再生障碍性贫血患者外周血淋巴细胞穿孔素基因突变检测及mRNA表达分析

作　者: 张剑
导　师: 付蓉
学　校: 天津医科大学
专　业: 内科学
关键词: 贫血再生障碍性穿孔素基因突变
分类号: R556
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的检测获得性重型再生障碍性贫血(SAA)患者外周血淋巴细胞基因组DNA穿孔素基因(PRF)编码序列突变形式及rs882822 SNP位点基因型、等位基因分布特点；检测SAA患者外周血淋巴细胞穿孔素mRNA表达水平,探索穿孔素基因与SAA发病之间的相关关系。方法应用聚合酶链反应(PCR)方法扩增31例SAA患者及15名正常对照外周血淋巴细胞基因组DNA穿孔素基因(PRF1)外显子2(EXON2)及外显子3(EXON3),双脱氧终止法测序,用generunner软件将所得序列与GenBank报道序列核对寻找基因突变位点；发现有突变序列将基因组克隆入M13噬菌体载体中,对所得两条染色体相应序列分别测序,以确定不同突变在染色体上的分布；根据测序峰图核对rs885822 SNP位点基因型分布,应用卡方检验统计方法计算rs885822SNP位点基因型分布是否符合遗传平衡(哈代-韦伯格平衡),应用卡方检验方法计算rs885822 SNP位点基因型及等位基因频率在SAA患者和正常对照是否存在差异；应用逆转录PCR (RT-PCR)方法提取SAA患者外周血淋巴细胞mRNA, PCR扩增穿孔素mRNA,琼脂糖凝胶电泳,gel pro软件进行半定量分析。独立样本T检验方法比较SAA患者与正常人外周血淋巴细胞穿孔素mRNA表达是否存在差异。结果：通过对31例SAA患者及15名正常人的外周血淋巴细胞基因组DNA穿孔素基因外显子2和外显子3直接测序,在一例女性SAA患者发现有822位C>T碱基突变,突变类型为纯合子突变,此碱基突变对氨基酸序列无影响。在一例男性SAA患者,发现907位G>A碱基突变,突变类型为杂合子突变,对氨基酸序列的影响为303位甲硫氨酸变成缬氨酸(Met303Val)。在正常人中没有发现存在突变样本；发现一处单核苷酸多态性位点(SNP)此位点已由SNP数据库报道,编号rs885822。此位点的分布符合哈代-韦伯格平衡(P>0.05),此位点基因型及等位基因频率分布在病例组与对照组之间有明显差异(P=0.016,P=0.021)；SAA初治患者与正常对照比较外周血淋巴细胞穿孔素mRNA表达有明显差异(P=0.048)结论：穿孔素基因在中国SAA患者中存在一定比例的突变,rs885822 SNP位点基因型及等位基因频率分布在SAA患者与正常人比较有差异,穿孔素基因突变可能是部分SAA患者患病的遗传易感因素：SAA初治患者与正常对照比较其外周血淋巴细胞穿孔素mRNA表达有明显差异,穿孔素可能是SAA发病的重要原因之

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
缩略语/符号说明  9-12
前言  12-17
  研究现状、成果  12-15
  研究目的、方法  15-17
一、SAA患者外周血淋巴细胞穿孔素基因突变的检测  17-31
  1.1 对象和方法  17-23
    1.1.1 病例和对照  17-18
    1.1.2 主要试剂与材料  18-19
    1.1.3 主要仪器设备  19
    1.1.4 实验方法  19-23
  1.2 结果  23-28
    1.2.1 SAA患者外周血淋巴细胞基因组PRF1基因点突变  23-27
    1.2.2 rs882522 SNP位点分析  27-28
  1.3 讨论  28-30
  1.4 小结  30-31
二、SAA患者外周血淋巴细胞穿孔素基因mRNA表达  31-40
  2.1 对象和方法  31-36
    2.1.1 病例和对照  31-32
    2.1.2 主要试剂与材料  32-33
    2.1.3 主要仪器设备  33
    2.1.4 实验方法  33-36
  2.2 结果  36-37
  2.3 讨论  37-39
  2.4 小结  39-40
结论  40-41
参考文献  41-45
发表论文和参加科研情况说明  45-46
综述获得性再生障碍性贫血患者遗传易感性研究进展  46-54
  综述参考文献  50-54
致谢  54

获得性重型再生障碍性贫血患者外周血淋巴细胞穿孔素基因突变检测及mRNA表达分析

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