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MAPK通路调控下经TGF-β_1/Smad信号途径的瘢痕疙瘩发病机制研究

作　者: 何淑芳
导　师: 杨雁
学　校: 安徽医科大学
专　业: 药理学
关键词: 瘢痕疙瘩 成纤维细胞 转化生长因子-β1 Smad 细胞外基质 促分裂原活化蛋白激酶 纤溶酶原激活剂抑制剂-1
分类号: R622
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


瘢痕疙瘩是一种以细胞外基质（extracellular matrix,ECM）成分,尤其是胶原组织过度沉积导致的纤维增生性疾病,但其病因及发病机制仍不清楚。目前研究认为转化生长因子β1（Transforming growth factor beta-1,TGF-β1）是瘢痕疙瘩最关键的致病因子,能促进成纤维细胞增殖及合成胶原,导致ECM沉积及纤维化。TGF-β1一方面主要通过Smad途径进行信号转导,另一方面TGF-β1还可激活促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）,主要包括细胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulated protein kinase,ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和p38通路。对于瘢痕疙瘩的发病机制,已有研究表明TGF-β1/Smad信号途径起重要作用,但Smad蛋白磷酸化的具体位点尚未明确;同时活化的MAPK通路如何调控TGF-β1/Smad途径尚有待探讨。为了阐明TGF-β1诱导Smad3蛋白C末端及连接区磷酸化在瘢痕疙瘩发病机制中的作用,以及MAPK通路对TGF-β1诱导Smad3活化、转位及靶暴因纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1）转录的调控作用,我们采用免疫沉淀及Western blot、细胞免疫荧光染色、荧光实时定量RT-PCR等分子生物学先进方法,主要从以下几个方面进行研究,结果如下:1.三种MAPK抑制因子对KFs内TGF-β1诱导的MAPK通路活化的抑制作用TGF-β1可增强KFs内MAPK通路的磷酸化水平,同时还能促进pERK、pJNK、pp38转位进入核内;ERK抑制因子、JNK抑制因子、p38抑制因子则分别明显抑制ERK、JNK、p38的磷酸化及转位入核。2.三种MAPK抑制因子对KFs内TGF-β1诱导的Smad3蛋白C末端及连接区磷酸化的调控作用TGF-β1可明显诱导KFs内Smad3蛋白C末端及连接区磷酸化（C-terminallyphosphorylated Smad3,pSmad3C;linker phosphorylated Smad3,pSmad3L）。p38抑制因子可明显抑制pSmad3C的表达,特别是几乎完全抑制pSamd3L的表达;ERK抑制因予及JNK抑制因子对Smad3的C末端及连接区磷酸化也有抑制作用。3.三种MAPK抑制因子对KFs内TGF-β1诱导的Smad2/3/4复合物形成及转位入核的调控作用TGF-βl显著诱导KFs内Smad2/3/4复合物的形成及转位入核,p38抑制因子几乎完全抑制复合物的形成,而ERK抑制因子及JNK抑制因子对复合物形成仅有微弱抑制作用。三种MAPK抑制因子作用下,复合物核内表达明显受到抑制。提示,p38抑制因子主要通过抑制复合物形成而阻碍其核内表达,ERK及JNK抑制因子虽然对复合物的形成没有明显抑制作用,但却能阻碍其转位入核。4.三种MAPK抑制因子对KFs内TGF-β1诱导的靶基因PAI-1mRNA表达的抑制作用三种MAPK抑制因子均能明显抑制KFs内TGF-β1诱导的靶基因PAI-1mRNA的表达。提示,ERK、JNK、p38通路均可能参与KFs内TGF-β1/Smad信号通路靶基因PAI-1转录活性的调控。综上所述,TGF-β1可明显诱导KFs内Smad3蛋白C末端及连接区磷酸化,从而促进Smad2/3/4复合物的形成及转位入核以及靶基因PAI-1表达。p38抑制因子主要通过抑制KFs内Smad3尤其是其连接区的磷峻化及Smad2/3/4复合物的形成,从而抑制靶基因PAI-1的转录,而ERK抑制因子及JNK抑制因子主要通过抑制阻碍Smad2/3/4复合物的转位入核来抑制靶基因PAI-1转录。以上结果阐明了KFs内MAPK通路调控TGF-β1/Smad信号途径的分子机制,为进一步开发治疗瘢痕疙瘩的新药提供了新的靶点。

全文目录


缩略词表  7-9
中文摘要  9-11
英文摘要  11-14
1.前言  14-15
2.材料与方法  15-25
  2.1 材料  15-20
    2.1.1 细胞  15
    2.1.2 试剂  15-16
    2.1.3 引物合成及序列  16
    2.1.4 主要仪器  16-17
    2.1.5 主要溶剂配制  17-20
  2.2 方法  20-22
    2.2.1 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导KFs内ERK、JNK、p38通路活化的抑制作用  20
    2.2.2 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导KFs内Smad3C、Smad3L磷酸化的影响  20-21
    2.2.3 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导KFs内Smad2/3/4复合物形成的影响  21
    2.2.4 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导Smads蛋白转位入核的影响  21
    2.2.5 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导KFs内PAI-1mRNA表达的影响  21-22
  2.3 检测方法  22-24
    2.3.1 细胞免疫荧光染色法  22
    2.3.2 免疫沉淀和Western blot分析  22-23
    2.3.3 SYBR Green Ⅰ荧光实时定量RT-PCR  23-24
  2.4 统计分析  24-25
3 结果  25-41
  3.1 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导的MAPK通路活化的抑制作用  25-29
  3.2 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导KFs内Smad3C磷酸化的影响  29-30
  3.3 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导KFs内Smad3L磷酸化的影响  30-31
  3.4 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导KFs内Smad2/3/4复合物形成的影响  31-32
  3.5 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导的磷酸化Smad3C、Smad3L转位的影响  32-34
  3.6 三种MAPK抑制因子对TGF-β_1诱导的KFs内PAI-1mRNA表达的影响  34-41
4 讨论  41-46
5 结论  46-47
参考文献  47-52
附录  52-53
致谢  53-54
综述  54-69

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 整形外科学（修复外科学） > 整形手术学
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