|
目的:利用大鼠腹主动脉-下腔静脉（arterio-venous,A-V）造瘘模型,观察血浆肾素、血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）和心肌组织中心脏营养素-1（Cardiotrophin-1,CT-1）在容量超负荷引起的心肌肥大中的可能作用,并初探相关机制。方法:1、采用腹主动脉-下腔静脉造瘘法,制备容量超负荷性心肌肥大大鼠模型。将连有注射器的9号注射针头斜向上先刺穿下腔静脉壁再刺穿A-V联合壁,若刺穿A-V联合壁时有突破感且可见鲜红色动脉血立即从穿刺针尾端流出,表明穿刺针尖已进入腹主动脉管腔,用肝素生理盐水冲洗管腔后退出针,于退穿刺针处缝合静脉壁创口,松开动脉阻断夹,可见下腔静脉较前增粗,变红,表明A-V造瘘成功。2、实验分组:将68只雄性SD大鼠随机分为:（1）正常组（n=8）:不做任何处理,正常饮食;（2）假手术组（n=8）:用连有注射器的9号静脉针头刺入大鼠下腔静脉,不刺穿A-V联合壁,余同模型组;（3）模型组:分别于A-V造瘘手术后的第1周、第2周、第4周和第8周末终止实验,即测量血压、采血和取出心脏后处死动物,共四组,每组8只;（4）傲坦组（Olmesartan,Olm,n=8）:模型组术后第5周开始用第七代AT1R拮抗剂（5mg/kg/d）灌胃,1次/天,持续4周;（5）洛汀新组（Lotensin,Lot,n=8）:模型组术后第5周用ACE拮抗剂（5mg/kg/d）灌胃给药,1次/天,持续4周。3、检测指标:心脏重量各参数心脏/体重比（HB/WB）、左心室质量指数（LVMI）、右心室质量指数（RVMI）检测;有创血压测定收缩压（SBP）、舒张压（DBP）和平均动脉压（MBP）;放免法测定血浆肾素、AngⅡ;免疫组织化学检测心肌组织中CT-1的表达及定位;Western-blot检测心肌组织CT-1和gp130表达。4、统计学处理所有数据输入计算机,用SPSS 13.0统计软件包进行单因素方差分析,方差齐者组间比较用LSD检验,方差不齐组间比较用Games-Howell检验,数据以均数±标准差（（?）±S）表示,检验水准α=0.05,P＜0.05认为有统计学意义。结果:1、容量超负荷性心肌肥大大鼠模型建立:（1）心脏质量检测:四个不同时间段（1、2、4和8周）模型组的HB/WB、LVMI、RVMI依次呈现增高的趋势,其中8周模型组的变化最显著,以上指标数据分别为:2.7±0.3、2.1±0.2、0.6±0.1,与假手术组（2.3±0.1、1.7±0.1、0.4±0.1）相比均具有显著性差异（P＜0.05,表1,图1）;与术后8周模型组比较,傲坦组和洛汀新组2个给药组均能减少HB/WB、LVMI、RVMI,分别是:0.4±0.1,0.5±0.0,0.4±0.1（P＜0.05,表1,图1）。（2）有创血压测量:与假手术组比较,模型组第1周末的平均动脉压增高111%,到第2周末达到最大141%,第4周末降低,第8周末恢复正常;与8周模型组比较,经过洛汀新和傲坦两组药物的干预后,只有傲坦组的MBP降低了10%,且有统计学意义（P＜0.05,表2,图2）。（3）右心室组织HE染色切片和免疫组化结果:HE染色:假手术组右心室组织排列整齐,心肌细胞的形态正常,间质无明显增生,无血管扩张及血管壁增厚等表现（图3A、3B）;8周模型组HE染色切片,可见心肌组织排列紊乱,心肌细胞体积增大,但是长度改变为主（图3C）;与8周模型组比较,经傲坦（图3E）药物的干预后,右心室组织排列恢复正常,心肌细胞的形态接近正常,间质无明显增生,其中傲坦组的切片心肌组织形态更接近假手术组;洛汀新组干预后组织形态的改变不大（图3D）。免疫组化:8周模型组右心室组织的排列紊乱,心肌细胞体积增大,但是以长度改变为主（图5C、5D）。2、血浆肾素和AngⅡ测定:血浆肾素的活性随着模型组时间的延长而降低,其中8周模型组最低达170%,与假手术组相比有统计学意义（P＜0.05,图4-1）,但血浆AngⅡ水平则显著增高,其中8周模型组最高达到192%,与假手术组相比有统计学意义（P＜0.05,图4-2）;与8周模型组比较,经过两组药物干预后,血浆肾素的活性均回升（P＜0.01,图4-1）,傲坦组血浆AngⅡ水平增高（P＜0.01,表3,图4-2）,洛汀新组则降低（P＜0.05,表3,图4-2）。3、心肌组织CT-1和gp130的表达（1）CT-1的表达:免疫组化:模型组CT-1表达的棕黄色阳性反应产物主要分布在胞膜区和胞浆区,而假手术组则是以胞浆表达为主;与假手术组平均光密度值（MOD）比较,8周模型组MOD显著升高（P＜0.05,表4,图5D,图6）;经过傲坦干预后,与8周模型组比较,傲坦组的心肌组织的形态接近正常,心肌细胞的排列整齐,细胞间质减少,CT-1表达的棕黄色阳性反应产物以细胞膜区降低为主（P＜0.05,表4,图5E）。Western-blot:与假手术组的MOD比较,8周模型组MOD升高161%（P＜0.01,表5,图7-8）。模型组1、2、4和8周CT-1的MOD值与RVMI相关分析呈显著性相关（r=0.925,P＜0.01,图9）;经过两组药物干预后,与8周模型组比较,傲坦组MOD降低146%（P＜0.05,表6,图10-11）,洛汀新组无统计学意义（P＞0.05,表6,图10-11）。（2）gp130的表达:Western-blot检测结果显示,与假手术组比较,模型组1、2、4和8周代表gp130蛋白表达的MOD依次升高,且8周模型组增高139%（P＜0.05,表7,图12-13）。经过两组药物干预后,与模型组比较,傲坦组MOD显著降低140%（P＜0.05,表7,图12-13）,洛汀新组无统计学意义（P＞0.05,表7,图12-13）。结论:1、AngⅡ参与容量超负荷引起的心肌肥大,此作用是通过AT1R来实现的;2、血浆AngⅡ含量升高可能不是来自血浆肾素,而是通过非ACE依赖途径实现的;3、CT-1的表达与容量超负荷性心肌肥大有关,可能通过gp130受体介导;4、CT-1诱导容量超负荷性心肌肥大作用可能与RAS有关。
|