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MMP-2-PEX慢病毒载体的构建及表达

作　者: 赵中松
导　师: 李锦毅
学　校: 辽宁医学院
专　业: 内科学
关键词: PEX基因信号肽基质金属蛋白酶慢病毒 293FT细胞
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的PEX是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)C端的血红素样结构域(hemopexin domain),作为内源性血管生成抑制剂,在抑制肿瘤侵袭与转移等方面发挥重要作用。本研究拟构建含人源MMP-2-PEX的重组慢病毒,作为目的基因PEX载体,实现PEX在真核细胞中稳定表达及MMP-9信号肽介导下的分泌。为进一步研究PEX在肿瘤治疗方面的作用提供实验基础。方法①TRIzol裂解法提取HT1080细胞总RNA,RT-PCR方法扩增MMP-2-PEX基因片段;②利用基因重组技术将MMP-9信号肽、MMP-2-PEX逐步插入pcDNA3.1(+)质粒,构建pcDNA3.1-sPEX,获得序列正确的融合基因sPEX;③将sPEX基因片段与慢病毒表达质粒pBPLV连接,获得重组质粒pBPLV-sPEX;④脂质体介导下质粒pBPLV-sPEX与慢病毒包膜质粒pLP/VSVG、包装质粒(pLP1、pLP2)共转染293FT,进行慢病毒包装及滴度测定;⑤重组慢病毒感染293FT细胞后,RT-PCR验证PEX转录水平表达;⑥Western-blot检测293FT细胞培养上清中PEX分泌表达;⑦鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管抑制实验验证PEX蛋白生物学活性。结果酶切和测序表明,慢病毒重组质粒pBPLV-sPEX构建正确;慢病毒包装四质粒共转染293FT细胞,成功获得高滴度PEX重组慢病毒;重组慢病毒感染293FT细胞后,RT-PCR方法检测到PEX转录水平高表达;在细胞培养上清中可检测到大量PEX蛋白;PEX蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成具有抑制作用。结论成功构建了MMP-2-PEX重组慢病毒,可高效的将MMP-2-PEX导入靶细胞,实现PEX持续表达及分泌;创建了一种PEX基因稳定转移及表达体系,为进一步研究PEX在肿瘤侵袭与转移中的作用提供了实验基础。

MMP-2-PEX慢病毒载体的构建及表达

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