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烟草核基质结合序列在转基因遗传稳定性中的功能及机理分析

作　者: 卢龙涛
导　师: 郑成超
学　校: 山东农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: MAR GUS活性转基因沉默遗传稳定性染色质敏感性外源基因表达启动子DNA甲基化
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目前通过植物转基因技术进行作物品种的改良已经成为作物品质改良的重要手段。我们都希望外源转入的优良基因能在作物中得到高效和稳定的表达,但是外源的基因在转入植物中一代或者几代后会出现不再表达、表达变弱的现象。这种现象的发生很大程度上是由于转基因沉默现象导致的。由于转基因沉默严重阻碍转基因商品化的进程,因此,如何提高转基因后代的遗传稳定性、减少转基因沉默的发生是一个亟待解决的问题。核基质结合区(Matrix Attachment Regions,MARs)是基因组上通常富含A/T的能够将DNA或染色质附着到核基质上的DNA序列。通过与结合蛋白的互作,MARs在维持或修饰DNA或染色质结构及调控相关基因方面表达中发挥重要作用。以往的研究者发现核基质结合序列在减少转基因沉默方面具有重要作用。TM6是本实验室从烟草核基质中分离得到的一个具有一般MARs结构特征的DNA序列,核基质体外结合实验证明TM6与烟草核基质具有很强的体外结合能力。为了研究TM6在植物体内的功能,主要是在其提高转基因后代遗传稳定性中的作用,我们构建不同的植物表达载体并转化了双子叶植物烟草和拟南芥,对转基因植株中TM6连接的外源基因的表达情况进行了分析。为了进一步研究TM6的作用机理,本实验还分析了TM6对其邻近启动子区域DNA甲基化的影响,主要实验结果如下:1.在双子叶植物烟草中,双TM6能够明显的降低杂交后代的转基因沉默比例,提高转基因后代的遗传稳定性。这个实验结果为TM6在提高外源基因在转基因植物中的遗传稳定性方面的应用提供了实验依据。2.烟草TM6序列能够显著提高侧翼启动子区对核酸酶的敏感性。在DNaseI处理后的转TM6的转基因烟草细胞核内,TM6显著降低了CaMV35S启动子区域的特异扩增水平,初步说明TM6能够减低其邻近启动子区域DNA甲基化水平,从而降低基因沉默的发生,提高基因表达。3.对转基因烟草中CaMV35S和NOS启动子区域的DNA甲基化程度进行检测,分析得知:在CaMV35S启动子区域,没有TM6的转基因烟草植株的DNA甲基化水平较高大约在13%～37%,而有TM6的转基因烟草植株中几乎没有DNA甲基化的发生;在NOS启动子区域,没有TM6的转基因烟草植株的DNA甲基化水平较高大约在24%～51%,而有TM6的转基因烟草植株的DNA甲基化水平在9%～14%左右。该实验进一步验证了TM6能够显著降低其邻近启动子区域DNA甲基化水平。4.双子叶植物烟草中分离的TM6同样可以在拟南芥中增强外源基因的表达,并且在不同类型的启动子(组成型35S启动子、冷诱导型COR启动子和光合组织特异型启动子PNZIP启动子)的驱动下都能有增强表达的作用。说明TM6是一个能广泛提高外源目的基因表达的核基质结合序列,并且这种对外源基因表达的提高并不改变启动子的作用类型。

全文目录

中文摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
1 引言  14-39
  1.1 植物转基因技术现状  14-15
  1.2 核基质结合序列（MARs）  15-29
    1.2.1 核基质结合序列（MARs）的发现  15-16
    1.2.2 核基质结合序列（MARs）的分离与鉴定  16-17
    1.2.3 核基质结合序列（MARs）的结构特征  17-18
    1.2.4 核基质结合序列（MARs）的分类  18-19
    1.2.5 核基质结合序列（MARs）对外源基因的影响  19-22
      1.2.5.1 核基质结合序列（MARs）对外源基因表达的影响  19-20
      1.2.5.2 核基质结合序列（MARs）对外源基因沉默的影响  20-21
      1.2.5.3 核基质结合序列（MARs）对外源基因转化频率的影响..  21-22
    1.2.6 核基质结合序列（MARs）的结合蛋白（MARs binding protei  22-26
    1.2.7 核基质结合序列（MARs）作用的分子机理  26-29
      1.2.7.1 核基质结合序列（MARs）的Loop 环模型  26-28
      1.2.7.2 核基质结合序列（MARs）序列作用的其它模型  28-29
  1.3 DNA 甲基化与去甲基化的分子生物学研究进展  29-38
    1.3.1 DNA 甲基化  29-30
    1.3.2 DNA 甲基化机制  30-34
    1.3.3 植物DNA 甲基化的生物学功能  34-37
      1.3.3.1 DNA 甲基化与植物生长发育  34-35
      1.3.3.2 DNA 甲基化可调节植物基因的表达  35-36
      1.3.3.3 基因组防御  36
      1.3.3.4 DNA 甲基化与转基因植株的基因沉默  36-37
    1.3.4 DNA 去甲基化  37-38
  1.4 研究目的与意义  38-39
2 材料与方法  39-55
  2.1 实验材料  39-41
    2.1.1 植物材料  39
    2.1.2 菌株与质粒  39
    2.1.3 酶与各种生化试剂  39-40
    2.1.4 实验用的引物  40-41
  2.2 实验方法  41-55
    2.2.1 植物表达载体的构建  41-45
      2.2.1.1 烟草和拟南芥基因组DNA 的提取（小量法）  41
      2.2.1.2 烟草TM6 MAR 序列的扩增  41-42
      2.2.1.3 凝胶电泳中DNA 片段的回收  42
      2.2.1.4 DNA 片段与克隆载体的连接  42-43
      2.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备  43
      2.2.1.6 大肠杆菌细胞的转化  43
      2.2.1.7 克隆载体的酶切鉴定  43-44
      2.2.1.8 质粒DNA 的提取  44-45
      2.2.1.9 烟草TM6 全长表达载体的构建  45
    2.2.2 植物表达载体的转化  45-48
      2.2.2.1 根癌农杆菌LBA4404、GV3101 感受态细胞的制备  45-46
      2.2.2.2 冻融法转化农杆菌  46
      2.2.2.3 农杆菌的培养  46
      2.2.2.4 农杆菌介导的烟草的转化  46-47
      2.2.2.5 农杆菌介导的拟南芥转化  47-48
      2.2.2.6 转基因烟草和拟南芥PCR 检测  48
    2.2.3 转基因植物的GUS 表达分析  48-51
      2.2.3.1 转基因烟草植株GUS 组织化学染色分析  48-49
      2.2.3.2 转基因植物GUS 基因表达的定量分析  49-51
    2.2.4 重亚硫酸盐测序法  51-54
      2.2.4.1 基因组DNA 的重亚硫酸氢钠化学修饰  51-53
      2.2.4.2 引物设计及PCR 扩增  53-54
    2.2.5 DNaseI 酶解处理与PCR 扩增  54-55
3 结果与分析  55-68
  3.1 TM6 对转基因后代遗传稳定性的影响  55-60
    3.1.1 烟草表达载体的构建  55
    3.1.2 转基因烟草植株的获得  55-56
    3.1.3 T_0 转基因烟草植株的GUS 活性分析  56-57
    3.1.4 BC_1 代烟草植株的获得  57
    3.1.5 BC_1 代烟草植株的组织化学染色分析  57-60
  3.2 TM6 对启动子区域DNA 甲基化的影响  60-68
    3.2.1 TM6 侧翼启动子区对DNaseI 敏感性分析  60-61
    3.2.2 重亚硫酸盐测序法对启动子区域DNA 甲基化的分析  61-68
      3.2.2.1 TM6 对35S-GUS 区域DNA 甲基化的影响  61-63
      3.2.2.2 TM6 对NOS 启动子区域DNA 甲基化的影响  63-68
3. TM6 序列在转基因拟南芥中对外源基因表达的影响  68-71
  3.1 拟南芥转化载体的构建  68-69
  3.2 转基因拟南芥植株的获得、鉴定以及纯合体的获得  69
  3.3 转基因拟南芥GUS 活性的测定  69-71
4. 讨论  71-75
  4.1 TM6 能减少转基因沉默的发生，增强外源基因在转基因后代中的遗传稳定性  71-73
  4.2 TM6 在拟南芥中也能提高外源基因表达  73-74
  4.3 TM6 的作用依赖于启动子类型，但不能改变启动子的作用模式  74
  4.4 研究设想  74-75
5 结论  75-76
参考文献  76-92
附录  92-97
致谢  97-98
入学以来已发表的论文及成果  98

烟草核基质结合序列在转基因遗传稳定性中的功能及机理分析

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