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杉木木材形成相关扩展蛋白基因组织定位研究

作　者: 王进军
导　师: 施季森
学　校: 南京林业大学
专　业: 遗传学
关键词: 杉木扩展蛋白基因ClEXP2 探针 RNA原位杂交组织定位
分类号: S791.27
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究在课题组已有的杉木分子木材形成的分子生物学研究基础上,利用RNA原位杂交技术对扩展蛋白基因ClEXP2在茎段组织中的表达进行了空间定位。主要结果如下:1.用杉木基因型020的当年生茎段为实验材料,制作石蜡切片。结果显示组织切片清晰完整。2.本研究中,用NBT/NCIP显色法对石蜡组织切片中内源性碱性磷酸酶进行检测显示,被检组织具有高丰度的蓝紫色斑点,且集中分布于髓、韧皮部和皮层中。这说明在本实验的活体组织切片中内源性的碱性磷酸酶具有活性,必须在原位杂交实验中进行内源性碱性磷酸酶的封阻。3.通过设计5’端加有酶切位点的特异引物扩增得到CLEXP2基因的280bp特异序列,构建至含有T7启动子的T载体,经线性化处理阳性克隆质粒,并以此为模板,合成了带有地高辛标记的CLEXP2基因mRNA反义探针。4.在用CLEXP2基因mRNA反义探针进行反复的原位杂交实验中发现,仅在实验组中检测到反义探针所具有的杂交信号,呈蓝紫色斑点零散分布于髓、形成层、韧皮部和皮层。本文RNA原位杂交试验体系和初步研究结果,为杉木形成层细胞的次生生长中扩展蛋白基因表达模式提供了有用的信息。

全文目录

致谢  3-4
摘要  4-5
Abstract  5-8
1 文献综述及本研究的目的意义  8-30
  1.1 扩展蛋白基因的研究进展  8-24
    1.1.1 扩展蛋白的发现  8-9
    1.1.2 扩展蛋白的结构和特点  9-11
      1.1.2.1 扩展蛋白的结构  9-10
      1.1.2.2 扩展蛋白的特点  10-11
    1.1.3 扩展蛋白伸展细胞壁的机制  11-13
    1.1.4 扩展蛋白的基因家族  13-15
    1.1.5 扩展蛋白基因的表达特性及表达调控  15-18
      1.1.5.1 扩展蛋白基因的特异性表达和功能冗余  15-16
      1.1.5.2 扩展蛋白基因表达作用的专一性  16
      1.1.5.3 扩展蛋白基因的表达调控  16-18
    1.1.6 扩展蛋白基因的功能分析  18-22
      1.1.6.1 扩展蛋白在木材形成中的作用  19
      1.1.6.2 扩展蛋白在根系发育中的作用  19-20
      1.1.6.3 扩展蛋白在果实发育和完熟中的作用  20
      1.1.6.4 扩展蛋白在叶生长发育中的作用  20-21
      1.1.6.5 扩展蛋白在植株整体及其他非营养器官生长中的作用  21-22
      1.1.6.6 其他生物类expansin研究  22
    1.1.7 展望  22-24
  1.2 RNA原位杂交技术的发展和应用  24-28
    1.2.1 RNA原位杂交技术的发展简史  24-26
    1.2.2 RNA原位杂交技术的原理  26
    1.2.3 RNA原位杂交技术在植物基因表达中的应用  26-28
      1.2.3.1 特异表达基因的组织细胞定位  26-27
      1.2.3.2 非特异表达基因的组织细胞定位  27
      1.2.3.3 基因的诱导表达研究  27
      1.2.3.4 RNA原位杂交与其它技术的结合应用  27-28
  1.3 课题研究的目的及意义  28-30
2 杉木茎段组织切片的制备和内源性碱性磷酸酶的检测  30-38
  2.1 杉木茎段组织切片的制备  30-32
    2.1.1 材料  30
    2.1.2 组织固定和包埋  30-31
    2.1.3 组织切片  31
    2.1.4 番红-固绿对染色  31-32
  2.2 内源性碱性磷酸酶(Endogenous Alkaline PhosPhatase，AP)活性的检测  32
  2.3 结果与讨论  32-38
    2.3.1 石蜡切片制作  32-33
    2.3.2 番红-固绿染色和固定液 FAA、PFA对切片效果的影响  33-34
    2.3.3 杉木当年生茎的解剖结构特征及其生态学意义  34-35
    2.3.4 内源性碱性酶的检测  35-38
3 CLEXP2特异序列 DIG探针合成及 RNA原位杂交  38-56
  3.1 CLEXP2特异序列的构建  38-39
  3.2 CLEXP2特异序列的扩增  39-44
    3.2.1 目的基因片段的菌液 PCR扩增  39
    3.2.2 目的基因片段的切胶回收  39-40
    3.2.3 回收产物与 T Easy载体的连接  40
    3.2.4 感受态细胞的制备  40-41
    3.2.5 筛选阳性克隆的菌株  41-44
  3.3 体外转录反应制备地高辛标记的 RNA探针  44
  3.4 斑点检测探针标记效率  44-45
  3.5 RNA原位杂交  45-49
    3.5.1 组织切片的制备  46
    3.5.2 原位杂交  46-49
  3.6 结果与分析  49-56
    3.6.1 探针合成结果  49-51
    3.6.2 原位杂交分析  51-56
4 总结与展望  56-58
参考文献  58-66
附录试剂配制  66-70
详细摘要  70-73

杉木木材形成相关扩展蛋白基因组织定位研究

内容摘要

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