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脑胶质瘤动物模型中血脑屏障紧密连接的变化

作　者: 王育胜
导　师: 柯以铨；陈祎招
学　校: 南方医科大学
专　业: 神经外科学
关键词: 脑胶质瘤血-脑屏障紧密连接 claudin-5
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景:脑胶质瘤是颅内发病率最高的原发性脑肿瘤,约占颅内肿瘤的40%左右。目前,即使采用手术、放疗、化疗等综合治疗,脑胶质瘤患者的平均五年生存率常不到30%。尽管近十年来,人们在脑胶质瘤的基础与临床研究方面都取得了很大的进步,但脑胶质瘤仍是致残率、致死率最高的恶性肿瘤之一。其中,作为胶质瘤最常见类型之一的胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM),其平均生存时间更在过去的三十年间无明显改善。从疾病的发生、发展过程来看,脑胶质瘤影响患者生活质量及导致患者死亡的原因主要来自两个方面:①肿瘤细胞本身的恶性增殖;②胶质瘤细胞作用于宿主并导致患者中枢神经系统多种病理生理变化及多种症状与并发症的产生。随着现代分子生物学的发展,人们在胶质瘤细胞恶性增殖分子机制方面取得了很大进展。但是,胶质瘤细胞如何引起中枢神经系统的多种病理生理变化?其分子机制如何?这是当前胶质瘤研究中的一个薄弱环节。众所周知,血脑屏障是维持中枢神经系统内环境稳定的结构基础,一般认为,血脑屏障基本结构包括:脑毛细血管内皮细胞及其间紧密连接,内皮基膜及星形胶质细胞终足形成的胶质膜。其中,脑毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接是血脑屏障机能与结构的主要基础。近年来,随着紧密连接基础研究所鹊玫木薮蠼?人们对紧密连接的蛋白组成及其生理功能有了崭新的认识,目前认为,紧密连接由一组蛋白分子所构成的复合体。这些分子包括:①跨膜蛋白,主要由claudins,occludins,junction associated molecules(JAM)等蛋白家族构成;②胞浆附属蛋白,主要由zonula occludens(ZO)等蛋白家族构成。细胞膜上这些紧密连接分子元件彼此相互作用并与邻近细胞膜上紧密连接蛋白相聚合、促使胞膜局部“融合”进而形成冰冻蚀刻电镜下紧密连接所表现的复杂三维网状超微结构。血脑屏障结构与功能的完整对维持神经系统的正常功能至关重要,同时,紧密连接结构与功能的变化也是多种神经系统疾病病理生理变化的核心过程。随着神经肿瘤学的发展,人们发现,胶质瘤细胞可以在其发生、发展过程中对血脑屏障产生多种作用进而导致多种神经系统症状及并发症的产生。关于脑胶质瘤中血脑屏障的形态学改变,许多文献叙述却不尽相同。而在胶质瘤对血脑屏障紧密连接的影响方面,不同的学者也取得了“开放”与“完整”的不同研究结果。为了研究胶质瘤细胞对血脑屏障的形态学改变,本研究通过建立脑胶质瘤动物模型,探索了胶质瘤细胞对血脑屏障的超微结构的影响;同时,随着现代分子生物学与实验技术的进步,如何从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的作用及其病理生理意义已成为神经肿瘤学研究的当务之急。为了研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接主要分子元件的表达变化,从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的影响以及其病理生理意义,本研究利用免疫组化及RT-PCR技术,探索了胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接分子元件claudins-5的作用及其可能的分子生物学与病理生理学机制。目的:1.建立接近人脑胶质瘤的血脑屏障体内模型,研究血脑屏障的生理及病理生理变化。2.研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接超微结构的变化,为脑胶质瘤中血脑屏障的形态学改变提供理论基础。3.研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接主要分子元件的表达变化,从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的影响以及其病理生理意义。方法:1.培养C6胶质瘤细胞,通过立体定向技术在Wister大鼠右侧尾状核建立脑胶质瘤动物模型;2.脑胶质瘤动物模型建立21天后,通过肉眼和运用MRI检查脑胶质瘤动物模型肿瘤的形成;3.采用透射电镜观察脑胶质瘤动物模型及正常Wister大鼠血脑屏障紧密连接的超微结构特征;4.运用免疫组织化学染色观察脑胶质瘤动物模型及正常Wister大鼠紧密连接蛋白claudin-5的表达;5.采用半定量RT-PCR的方法探索胶质瘤细胞对血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白分子元件claudin-5表达的影响。6.统计学分析:采用SPSS13.0统计软件包分析。数据均以x~-±s表示,不同部位及正常组claudin-5 mRNA条带OD值比较采用单向方差分析和多重比较,如果满足方差齐性采用Fisher方差分析及LSD法进行多重比较,若不满足方差齐性采用近似F检验Welch法方差分析及Tambanes’s T2法进行多重比较,以P≤0.05为差异有显著性意义。结果:1.C6肿瘤细胞接种于Wister大鼠右侧尾状核21天后,肉眼及MRI可见脑胶质瘤动物模型右脑形成肿瘤,肿瘤占位效应明显,肿瘤周边有局部水肿。2.透射电镜下,正常Wister大鼠脑组织微血管相邻内皮细胞间可见连续条带状的紧密连接,细胞间未见裂隙;在脑胶质瘤肿瘤中心组织,仅有22.23%微血管相邻内皮细胞间可见条带状紧密连接,其余内皮细胞间可见明显裂隙,部分内皮细胞间连接为缝隙连接;在脑胶质瘤肿瘤边缘组织中,有57.15%微血管内皮细胞间存在紧密连接,其余内皮细胞间局部可见裂隙,部分内皮细胞间可见缝隙连接。在脑胶质瘤肿瘤远隔部位,有95.65%微血管相邻内皮细胞紧密连接未见破坏,细胞间紧密连接为连续条带状。距肿瘤中心越远,相邻微血管内皮细胞间紧密连接越完整。3.胶质瘤细胞作用21天后,免疫组织化学染色观察紧密连接蛋白claudin-5的表达,发现正常Wister大鼠脑组织微血管内皮细胞claudin-5呈强阳性表达,而肿瘤中心组织微血管内皮细胞claudin-5表达呈阴性;肿瘤边缘微血管内皮细胞claudin-5呈弱阳性表达。4.RT-PCR结果显示肿瘤边缘和肿瘤中心claudin-5表达明显减少,与正常脑组织相比,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000),肿瘤远隔部位claudin-5表达也减少,但差异无统计学意义(P=0.960)。结论:1.通过立体定向技术可以成功在Wister大鼠右侧尾状核建立C6脑胶质瘤动物模型,并且通过MRI可见肿瘤占位效应明显,局部形成水肿带。2.胶质瘤细胞在其发生、发展过程中可破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接超微结构。3.在C6脑胶质瘤动物模型不同位置的脑组织中,血脑屏障紧密连接受破坏的程度不同。4.胶质瘤细胞可以降低血脑屏障内皮细胞claudin-5的表达,这一过程可能参与了血脑屏障紧密连接的破坏。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-14
前言  14-16
  参考文献  15-16
第一章脑胶质瘤动物模型的建立  16-26
  1、引言  16
  2、材料  16-19
  3、方法  19-22
  4、结果  22
  5、讨论  22-24
  6、参考文献  24-25
  7、附图  25-26
第二章脑胶质瘤血脑屏障紧密连接超微结构的变化  26-35
  1、引言  26
  2、材料  26-29
  3、方法  29
  4、结果  29-30
  5、讨论  30-32
  6、参考文献  32-33
  7、附图  33-35
第三章脑胶质瘤血脑屏障紧密连接主要分子元件Claudin-5的表达变化  35-48
  1、引言  35
  2、材料  35-40
  3、方法  40-42
  4、结果  42-43
  5、讨论  43-45
  6、参考文献  45-47
  7、附图  47-48
全文小结  48-49
文献综述  49-56
硕士研究生期间基金项目、发表论文  56-57
中英文对照缩略词表  57-58
致谢  58-60
统计学证明  60-61

脑胶质瘤动物模型中血脑屏障紧密连接的变化

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