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空肠弯曲菌流行病学及在鸡肉低温贮藏过程中失活动力学特征研究

作　者: 姜峰
导　师: 焦新安
学　校: 扬州大学
专　业: 遗传学
关键词: 空肠弯曲菌结肠弯曲菌多重PCR 流行病学药敏试验失活动力学
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

空肠弯曲菌是全球范围内主要的细菌性肠道病原菌。近年来许多国家人空肠弯曲菌病的发生率呈指数增长趋势,但其中的原因尚未揭示。虽然空肠弯曲菌有多种传播途径,但是消费鸡肉被认为与人感染弯曲菌密切相关。降低鸡肉中空肠弯曲菌的感染量是控制人弯曲菌病的主要途径。此外,由于空肠弯曲菌耐药性的不断出现,食品安全和食源性疾病的问题已日益突出,成为公共卫生关注的新焦点。本研究的目的是:(1)对医院腹泻人群、食品从业健康人群、农贸市场食物、宠物群体弯曲菌的感染流行状况进行初步调查研究;(2)应用国标方法鉴定分离株的生化特性,并应用2007年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐使用的琼脂扩散法进行耐药分析;(3)对低温贮藏过程中弯曲菌在鸡肉表面的失活动力学特征进行初步研究。一、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的流行病学调查自2007年1月至2008年12月采集扬州市区2所医院腹泻人群的粪便样品2,758份,扬州市疾病预防控制中心健康体检人群的肛拭样品2,771份,扬州市区四个主要农贸市场食品样本1,149份,扬州和上海地区宠物门诊以及饲养场的宠物肛拭样品510份。以国标法为参照,采用增菌培养、选择性培养和多重PCR鉴定方法对上述样品进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离鉴定。结果显示,医院粪便样品中,空肠弯曲菌阳性率为4.5%(124/2,758),结肠弯曲菌阳性率为0.4%(11/2,758)。本室4年的统计数据表明,不同医院的感染率差异不显著(p>0.05),门诊部的感染率极显著高于住院部的(p<0.01),6月-10月份的感染率显著高于11月-2月和3月-5月的感染率(p<0.05)。食品从业健康人群的样品中,空肠弯曲菌阳性0.14%(4/2,771)。腹泻人群感染率极显著高于健康人群(P<0.01)。农贸市场食品样本中,空肠弯曲菌阳性率为1.91%(22/1,149),结肠弯曲菌阳性率为1.22%(14/1,149)。宠物犬门诊样本中,空肠弯曲菌阳性率为5.36 %(18/336),结肠弯曲菌阳性率为1.79%(6/336)。宠物饲养基地以及犬防样品中,空肠弯曲菌阳性阳性率为1.75%(3/174)。从以上结果可以看出,空肠弯曲菌是引起腹泻的重要的病原。宠物犬和食品是空肠弯曲菌感染人的重要途径。加强对宠物源、食品源弯曲菌的控制,有助于预防和控制弯曲菌病的发生和传播。二、弯曲菌分离株的耐药性分析采用国标方法和2007年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐使用的琼脂扩散法对96株人源空肠弯曲菌、22株市场源空肠弯曲菌、15株宠物源空肠弯曲菌,以及21株结肠弯曲菌的耐药性进行了研究。药敏实验结果显示,133株空肠弯曲菌对8大类21种抗生素高度敏感的是:头孢噻肟96.24%、庆大霉素94.74%、红霉素92.48%、阿齐红霉素91.73%、阿莫西林85.71%,高度耐药的是:头孢哌酮100%、头孢拉定97.74%、萘啶酸90.23%、头孢克罗90.22%、复方新诺明87.97%、环丙沙星87.22%、诺氟沙星85.71%、左旋氧氟沙星84.36%、恩诺沙星84.96%、四环素82.70%。耐药菌株的多重耐药分布于2耐到17耐不等,主要集中在8耐到14耐,占87.22%。21株结肠弯曲菌对临床常用的抗生素高度敏感的是:头孢噻肟95.24%、阿莫西林85.72%、红霉素85.72%、阿齐红霉素90.48%、克林霉素80.95%;高度耐药的是:头孢拉定100%、恩诺沙星100%、头孢哌酮100%、左旋氧氟沙星100%、萘定酮酸100%、复方新诺明100%、强力霉素100%、环丙沙星95.24%、四环素95.24%、头孢克罗95.24%、诺氟沙星90.48%、土霉素85.72%、青霉素80.95%。其中多重耐药菌株主要分布在11耐、14耐和17耐。药敏实验结果表明,133株不同来源的空肠弯曲菌只对氨基糖甙类和大环内脂类抗生素较为敏感,对喹诺酮类、磺胺类、四环素类和大多数头孢菌素类抗生素均产生了不同程度的耐药性。不同来源空肠弯曲菌的多重耐药的现象十分严重,耐药谱也较宽,其中市场来源的菌株耐药谱最宽。而人源菌株与宠物犬菌株的耐药谱较为接近,这可能与两者接触更为频繁有关。必须加强各地弯曲菌耐药性和抗生素使用情况的监测,及时调整用药方案和公共卫生策略。三、空肠弯曲菌在鸡肉低温贮藏过程中的失活动力学特征空肠弯曲菌对低温较为敏感,低温贮藏是降低鸡肉表面弯曲菌数量较为有效的措施之一。为了了解空肠弯曲菌在鸡肉低温贮藏过程中的失活动力学特征,并为鸡肉产品中弯曲菌的风险评估提供有力数据。为此研究了-20℃、4℃低温贮藏温度条件下三株空肠弯曲菌(ATCC33560,JR0706-2,ALM-80)在鸡肉表面的失活动力学特征。结果表明:-20℃温度条件下在55d贮藏期内鸡肉样品中3株空肠弯曲菌的残活细胞数分别降低了3.16,2.87,3.14 logCFU/g。残活率在冷冻起始20d内,呈现缓慢下降趋势;20d至45d的下降速度较快;接着在45天至55天的下降速度放缓。4℃温度条件下在10d贮藏期内鸡肉样品中3株空肠弯曲菌的残活细胞数分别降低了3.47,3.35,3.51logCFU/g。平均失活率分别为0.347lgCFU/d,0.355lgCFU/d,0.439LgCFU/d。不同的空肠弯曲菌菌株在-20℃和4℃低温贮藏过程中残活率的对数值下降幅度存在差别,但三株细菌之间残活率变化趋势没有显著区别(P>0.05)。应用软件对所得数据进行拟合,结果表明所得到的失活动力学方程与实际观测值吻合度较高。冷链在鸡肉产品的销售过程中起到至关重要的作用,然而在实际生产生活中鸡肉产品往往会有一段时间处在冷链系统之外,存在反复冻融的情况。为了研究反复冻融对鸡肉表面弯曲菌的活力的影响,我们进行了8次冻融实验,结果表明:空肠弯曲的残活细胞数降低了2.758 logCFU/g。细菌的残活曲线呈现先快后慢的下降趋势。第1到5次的冻融操作过程中,平均失活率为0.432logCFU/次。第6到8次冻融过程中平均失活率为0.07logCFU/次。说明反复冻融的操作可以起到降低鸡肉表面空肠弯曲菌数量的效果。为了研究在冷链系统之外鸡肉表面空肠弯曲菌的数量变化,在冻融试验中预设了三个“事故点”,模拟冷链失效3,6,12小时后鸡肉表面空肠弯曲菌数量在不同外界温度环境下的变化规律。在前两个“事故点”(第一、二次冻融实验)0℃和25℃环境温度下,鸡肉表面空肠弯曲菌存活细胞数没有显著的变化;37℃环境温度下,细菌呈现缓慢增殖。在第三个“事故点”(第三次冻融实验)0℃和25℃环境温度下,鸡肉表面空肠弯曲菌存活细胞数呈现下降趋势,而37℃环境温度下,细菌数量保持稳定。说明冷链是防止鸡肉表面弯曲菌增殖较为行之有效的方法。把握空肠弯曲菌在低温贮藏过程中的失活动力学特征可以对温度采取严格的控制,保证鸡肉产品的质量安全,力求提供给消费者新鲜健康的鸡肉产品。

全文目录

中文摘要  3-6
ABSTRACT  6-13
第一章文献综述  13-34
  1. 概述  13-14
  2. 临床特征与疾病负担  14-17
    2.1 临床表现  14-15
    2.2 格林-巴利综合症  15
    2.3 弯曲菌感染与HIV  15-16
    2.4 人弯曲菌病造成的疾病负担  16-17
  3. 流行病学特征  17-23
    3.1 发病率  17-18
      3.1.1 发展中国家  17
      3.1.2 发达国家  17-18
    3.2 人口统计学数据  18-20
      3.2.1 感染年龄  18-19
      3.2.2 儿童与弯曲菌肠炎  19-20
      3.2.3 种族性  20
      3.2.4 性别  20
    3.3 季节变化  20-21
    3.4 弯曲菌与旅行腹泻  21-22
    3.5 弯曲菌与其他微生物的共感染  22
    3.6 弯曲菌种的分布  22-23
  4. 弯曲菌的研究进展  23-27
    4.1 免疫学方面  23-24
    4.2 人弯曲菌病的风险因素  24-27
      4.2.1 弯曲菌的散发感染  24-25
      4.2.2 弯曲菌的暴发  25-27
  5. 参考文献  27-34
第二章空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的流行病学调查  34-55
  1 材料与方法  35-39
    1.1 材料  35-37
      1.1.1 菌株  35
      1.1.2 培养基和抗生素  35
      1.1.3 试剂  35
      1.1.4 样品来源  35-36
      1.1.5 样品采集与运输  36-37
    1.2 方法  37-39
      1.2.1 抗生素和弯曲菌生长促进剂的配制  37
      1.2.2 培养基的配制  37
      1.2.3 样本处理  37-38
      1.2.4 模板制备  38
      1.2.5 多重PCR 方法  38
      1.2.6 细菌分离纯化  38
      1.2.7 菌种保存  38-39
      1.2.8 统计学分析  39
  2. 结果  39-48
    2.1 腹泻患者中弯曲菌的流行病学分析  39-44
      2.1.1 不同医院统计  39-40
      2.1.2 不同诊区统计  40
      2.1.3 不同月份统计  40-41
      2.1.4 2005 年至2008 年的流行病学调查结果  41-44
        2.1.4.1 不同年份统计  41-43
        2.1.4.2 不同月份统计  43
        2.1.4.3 不同医院统计  43-44
        2.1.4.4 不同诊区统计  44
    2.2 食品从业人群中弯曲菌的流行病学分析  44-45
    2.3 农贸市场食品样品中弯曲菌的流行病学分析  45-46
      2.3.1 不同样品  45
      2.3.2 不同农贸市场  45-46
    2.4 宠物群体中弯曲菌的流行病学分析  46-48
      2.4.1 宠物门诊结果统计  46-48
        2.4.1.1 不同症状统计  46-47
        2.4.1.2 不同年龄统计  47-48
        2.4.1.3 不同地域统计  48
      2.4.2 宠物饲养基地及犬防采样结果统计  48
  3. 讨论  48-52
  4. 参考文献  52-55
第三章弯曲菌分离株的耐药性分析  55-72
  1 材料和方法  56-57
    1.1 材料  56-57
      1.1.1 标准菌株  56
      1.1.2 菌株来源  56
      1.1.3 试剂  56-57
    1.2 药敏试验方法  57
  2 结果  57-66
    2.1 空肠弯曲菌的耐药性分析  57-63
      2.1.1 人源空肠弯曲菌耐药性分析  58-59
      2.1.2 不同医院、不同诊区空肠弯曲菌耐药率比较  59-60
      2.1.3 市场源空肠弯曲菌耐药性分析  60-61
      2.1.4 宠物来源空肠弯曲菌耐药性分析  61-62
      2.1.5 不同来源空肠弯曲菌耐药性分析比较  62-63
    2.2 空肠弯曲菌的耐药谱分析  63-65
      2.2.1 人源空肠弯曲菌的耐药谱分析  63-64
      2.2.2 市场来源和宠物来源空肠弯曲菌的耐药谱分析  64
      2.2.3 不同来源空肠弯曲菌耐药谱的分布比较  64-65
    2.3 结肠弯曲菌耐药性分析  65
    2.4 结肠弯曲菌耐药谱分析  65-66
  3 讨论  66-69
  4. 参考文献  69-72
第四章低温贮藏过程中空肠弯曲菌在鸡肉表面的失活动力学特征  72-89
  1 材料和方法  73-76
    1.1 材料  73-74
      1.1.1 菌株来源  73-74
      1.1.2 培养基  74
      1.1.3 试剂与仪器  74
    1.2 方法  74-76
      1.2.1 细菌培养与收集  74
      1.2.2 鸡肉样品的处理  74-75
      1.2.3 残活细胞数的测定  75
      1.2.4 空肠弯曲菌失活动力学模型的建立  75
      1.2.5 反复冻融对空肠弯曲菌活力的影响  75
      1.2.6 模拟冷链失效情况下鸡肉表面弯曲菌活力特征  75-76
  2 结果  76-84
    2.1 细菌计数的稳定性和可信度  76
    2.2 不同空肠弯曲菌在－20℃冷冻过程中的失活动力学特征  76-79
      2.2.1 55D 贮藏期内空肠弯曲菌的失活曲线  76-77
      2.2.2 冷冻条件下空肠弯曲菌失活动力学方程的建立  77-78
      2.2.3 失活动力学方程的评价  78-79
    2.3 不同空肠弯曲菌在4℃冷藏过程中的失活动力学特征  79-81
      2.3.1 10D 贮藏期内空肠弯曲菌的失活曲线  79
      2.3.2 冷藏条件下空肠弯曲菌失活动力学方程的建立  79-81
      2.3.3 失活动力学方程的评价  81
    2.4 反复冻融对空肠弯曲菌活力的影响  81-82
    2.5 模拟冷链失效情况下鸡肉表面弯曲菌活力特征  82-84
  3 讨论  84-87
  4. 参考文献  87-89
致谢  89

空肠弯曲菌流行病学及在鸡肉低温贮藏过程中失活动力学特征研究

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