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牛外周血中单核细胞和巨噬细胞及其TLRs家族基因的相关研究

作　者: 郭熠洁
导　师: 赵国琦
学　校: 扬州大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: Toll样受体牛单核细胞单核细胞由来的巨噬细胞细胞因子脂多糖逆转录聚合酶链反应荧光免疫试验细胞流式分离方法
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

单核细胞和巨噬细胞在抵抗和防御病原体感染中发挥了重要作用,尤其是在细胞内的病原体防御中发挥了巨大作用。根据组织内环境以及它们自身所处的不同分化阶段,它们都表现出不同的形态、机能和代谢作用。这些细胞可以通过细胞表面表达的TLR来识别和结合PAMP引发信号传导通路从而激发宿主的防御系统。至今为止,已经发现了TLR1-TLR10的部分基因序列,然而对牛外周血单核细胞及其巨噬细胞中Toll样受体的表达形式还不清除。因此本试验采取单核细胞以及由来巨噬细胞进行研究,主要研究牛外周血中此类细胞Toll样受体的表达形式,及其在LPS刺激条件下细胞因子的表达,从而得知该细胞在宿主免疫中发挥的重要作用。试验一牛外周血单核细胞和巨噬细胞分离培养和纯化方法本试验采用流式细胞分离仪和磁性细胞分离仪分离和鉴定了外周血中单核细胞及其由来的巨噬细胞,通过使用Repcell细胞培养板培养巨噬细胞,改进了Taflon Bag培养巨噬细胞的方法,且单核细胞和巨噬细胞的分离百分率分别为97.9%和73.9%。从而简化的了试验步骤,为以后的试验奠定了坚实的基础。试验二牛外周血单核细胞和巨噬细胞Toll样受体mRNA水平的表达形式通过RT-PCR和NIH光密度成像系统分析得到单核细胞和巨噬细胞TLRs mRNA的表达形式,并测得在LPS刺激时,TLRs家族中不同TLR对LPS的反应能力。研究发现,巨噬细胞在LPS刺激24h后,IL-6和TNF-αmRNA的表达量显著升高(P<0.05),表达量分别为2.02±0.48和1.66±0.39。与此同时IL-8 mRNA的表达量相对提高,即2.14±0.52。TLR1、TLR3、TLR5、TLR8和TLR10的转录产物显著下降(P<0.05),然而TLR2、TLR4、TLR6和TLR7则保持稳定。另外单核细胞的Toll样受体1-10以及细胞因子的表达量在LPS刺激前后保持稳定,其中TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR10的表达量高于1.0, IL-8和IL-6的表达量大于TNF-α,它们在LPS刺激后的表达量分别为1.38±0.41、1.47±0.17和1.21±0.51,与单核细胞相似的是TLR9不管是在正常培养条件下还是LPS刺激条件下都没有表达。试验结果表明,巨噬细胞在受到病原刺激后通过提高IL-6和TNF-αmRNA的表达量从而提高了天然免疫的作用。该研究为探讨巨噬细胞在天然免疫中的作用奠定了基础。第三章牛外周血单核细胞和巨噬细胞中Toll样受体蛋白质水平的表达形式本试验通过使用荧光免疫染色、流式细胞分离仪和共聚焦电镜,分析得知TLR2和TLR4在单核细胞和巨噬细胞表面的分布形式以及蛋白水平的表达量,并研究了在LPS刺激条件下,TLR2和TLR4的变化情况。试验结果表明,单核细胞和巨噬细胞在受到LPS刺激24h后,TLR2和TLR4蛋白水平表达量相对提高,分别为34.1%、47.1%和22.4%、10.1%,TLR2和TLR4蛋白水平的表达量与mRNA水平的表达形式一致,从而充分证实了TLR2和TLR4在单核细胞和巨噬细胞抵抗病原物质感染时发挥了重要作用。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-12
文献综述  12-23
  1 Toll 样受体家族的发现  12-14
  2 TLR在宿主防御中的作用  14-17
  3 牛的TLR  17-18
  4 TLR 介导的免疫调节  18-20
  5 TLRs介导的信号传导通路  20-21
  6 本论文研究的意义及主要内容  21-23
试验部分  23-48
  第一章牛外周血单核细胞和巨噬细胞分离培养和纯化方法  23-30
    1 材料与方法  23-26
      1.1 试验动物  23
      1.2 外周血淋巴细胞的分离以及单核细胞和巨噬细胞的培养  23-25
      1.3 Flow cytometry解析  25
      1.4 May-Grunwald Giemsa染色  25-26
    2 结果与分析  26-28
      2.1 单核细胞和巨噬细胞的形态特征  26-27
      2.2 CD14 表面抗体在单核细胞和巨噬细胞中的表达  27-28
    3 讨论  28-29
    4 小结  29-30
  第二章牛外周血单核细胞和巨噬细胞中Toll样受体m RNA水平的表达量  30-40
    1 材料与方法  30-34
      1.1 试验动物  30
      1.2 外周血淋巴细胞的分离  30
      1.3 Magnetic cell sorting(MACS)法分离单核细胞(Mo)  30
      1.4 单核细胞由来的巨噬细胞(Mod-Mφ)的分离和培养  30-31
      1.5 Lipopolysaccarid（LPS，脂多糖）刺激培养  31
      1.6 RNA 提取  31-32
      1.7 RT-PCR 法  32-33
      1.8 凝胶电泳  33-34
      1.9 统计分析  34
    2 结果与分析  34-37
      2.1 单核细胞中细胞因子mRNA 在LPS 刺激作用下的变化  34
      2.2 单核细胞中Toll样受体mRNA在LPS刺激作用下的变化  34-35
      2.3 单核细胞由来的巨噬细胞中细胞因子mRNA 在LPS 刺激作用下的变化  35-36
      2.4 单核细胞由来的巨噬细胞中Toll样受体mRNA在LPS刺激作用下的变化  36-37
    3 讨论  37-39
    4 小结  39-40
  第三章牛外周血单核细胞和巨噬细胞中 Toll 样受体蛋白质水平的表达量  40-48
    1 材料与方法  40-41
      1.1 试验动物  40
      1.2 外周血淋巴细胞的分离以及单核细胞和巨噬细胞的培养  40
      1.3 荧光免疫染色  40-41
      1.4 Flow cytometry 解析  41
      1.5 Lipopolysaccarid(LPS，脂多糖)刺激培养  41
    2 结果与分析  41-45
      2.1 单核细胞表面TLR2 和TLR4 的分布  41
      2.2 单核细胞由来的巨噬细胞表面TLR2 和TLR4 的分布  41-43
      2.3 单核细胞TLR2 和TLR4 蛋白质水平的表达  43
      2.4 LPS 刺激条件下单核细胞TLR2 和TLR4 蛋白质水平的表达  43-44
      2.5 单核细胞由来的巨噬细胞TLR2 和TLR4 蛋白质水平的表达  44-45
      2.6 LPS刺激条件下单核细胞TLR2和TLR4蛋白质水平的表达  45
    3 讨论  45-47
    4 结论  47-48
结论与研究展望  48-49
参考文献  49-57
致谢  57-58
攻读学位期间发表的学术论文目录  58

牛外周血中单核细胞和巨噬细胞及其TLRs家族基因的相关研究

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